UPLC-QqQ-MS法测定福建灵芝中灵芝烯酸D的含量及其在产地追溯中的应用

张基荣,蒋昆霞,许 文*,林 羽,徐 伟,吴长辉

(1. 福建中医药大学药学院,福建 福州 350122; 2. 福建中医药大学科技创新与中心,福建 福州 350122; 3. 福建仙芝楼科技有限公司,福建 南平 350002)

灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss ex Fr.) Karst或紫芝GanodermasinenceZhao, Xu et Zhang的干燥子实体,性甘,平,具有治疗心神不宁,失眠心悸等功效[1]。灵芝含有多类成分,三萜酸类为其主要有效成分之一,现代药理研究发现,灵芝中的三萜酸类成分具有抗肿瘤[2]、抗氧化[3]、抗炎[4]、抗菌[5]等作用。福建灵芝作为全国灵芝的主产区之一,具有悠久的药用、食用历史,是福建地区重要的道地药材之一,福建灵芝以武夷山脉的南平为主要种植基地,2021年福建省灵芝种植总面积超2000公顷,产品远销全国各地[6]。

中药材的追溯,目前国家出台了系列的文件工作,产地的追溯与道地药材的道地性以及优质优价相关[7],建立中药产品从种质种源、种植生产、采收加工、仓储运输、市场销售的全过程质量追溯是目前保障药材质量的重要方法[8]。2012年国家就颁布《关于开展中药材流通追溯体系建设试点的通知》,2015年,国务院发布的《关于加快推进重要产品追溯体系建设的意见》[9];2019、2020年国家科技部国家重点研发专项将中药材质量追溯要求列入研究指南;2021年,福建省食品药品监督管理局《福建省规范中药材产地趁鲜加工工作指导意见(试行)》将福建灵芝纳入中药材质量追溯体系建设;2022年,福建省药监局发布《关于推进中药饮片信息化追溯体系建设工作的通知》,力求中药饮片全过程质量追溯[10]。因此,构建福建灵芝药材的质量追溯方法对于高品质灵芝药材的全链条质量追溯具有重要意义。然而,目前针对福建灵芝同其他地区灵芝的质量溯源研究比较较少,课题组汪丽娜采用高效液相指纹图谱方法结合PCA、OPLS-DA等化学计量学开展对福建灵芝的检测,并对比了福建灵芝同其他地区灵芝中药指纹图谱差异性[11],发现灵芝烯酸D是差异性成分,课题组进一步采用薄层色谱法分析发现福建灵芝及其他产地的灵芝的差异性鉴别成分为灵芝烯酸D,即灵芝烯酸D薄层斑点在福建灵芝中显色明显,但是从含量上能否用于产地的追溯尚未见研究。

目前针对灵芝烯酸D的测定方法主要包括高效液相色谱(HPLC)法[12,13]和HPLC-MS质谱法[14-16],但是现有的文献的研究均鲜有涉及福建灵芝的样品,相关建立的方法在前期用于福建灵芝时存在着灵敏度低、色谱峰分离度不佳、分析时间较长等问题。随着现代分析技术的快速发展,UPLC-QqQ-MS法在中药含量测定分析方面应用广泛,具有分析灵敏、快速的特点[17]。因此,本文采用UPLC-QqQ-MS法,优化色谱条件和质谱条件,构建福建灵芝中灵芝烯酸D成分的含量测定方法,并比较福建灵芝与吉林、浙江、安徽三个不同产区赤芝灵芝烯酸D的含量差异,为福建灵芝质量溯源提供一种新的技术手段。

1 材料

1.1 药材

灵芝药材收集于福建(批号:S1～S4)、吉林(批号:S5～S8)、浙江(批号:S9～S12)、安徽(批号:S13～S16)地区,16批灵芝药材标本经福建中医药大学药学院药用植物学实验室范世明正高级实验师鉴定为多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss ex Fr.) Karst的干燥子实体。

1.2 试剂

对照品灵芝烯酸D,实验室自制,纯度大于98%;地塞米松作为内标,批号:100318-2019014购于中国食品药品检定研究院,甲醇、乙腈为色谱纯(德国Merck公司);Milli-Q超纯水(美国Millipore公司);其余试剂均为分析纯。

图1 灵芝烯酸D和内标(地塞米松)的化学结构图

1.3 仪器和试剂

ACQUITY UPLC I-Class串联Xevo-TQS型超高效(UPLC)液相-三重四级杆(QQQ)质谱(美国Waters公司);EX225DZH/AD型十万分之一精密自动分析天平(美国OHAUS公司);KQ-500DE型台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);M100型莱兹研磨仪(德国莱兹公司),默克merck公司质谱级水。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

色谱条件:采用Waters UPLC CORTECS C18色谱柱(4.6 mm×100 mm, 1.6 μm)色谱柱,以有机相乙腈(A)-水相0.1%甲酸水溶液(B)为流动相,进行梯度洗脱(0～9.5 min, 25%A; 9.5～11.5 min, 25%～31%A; 11.5～16.5 min, 31%A; 16.5～19 min, 31%～43%A),流速0.25 mL/min,柱温40℃,进样量2 μL。

质谱条件:ESI多反应监测(MRM)模式,毛细管电压2.5 KV,锥孔电压3.00 V,脱溶剂气流N2800 L·h-1,脱溶剂温度500℃,锥孔气流N250 L·h-1,离子源温度150℃,Extractor 3.00 V,碰撞气体氩气。灵芝烯酸D、内标物的MS参数见表1。空白溶剂、灵芝烯酸D、地塞米松(IS)与灵芝样品MRM离子流图,见图2。

表1 灵芝烯酸D质谱参数

图2 空白溶剂(A)、对照品(B)与S1批次福建灵芝样品(C)的离子流色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液及内标溶液的制备

对照品溶液的制备:精密称取灵芝烯酸D的对照品适量用甲醇溶解制备成浓度分别为1.31mg/mL的对照品母液,精密移取灵芝烯酸D对照品母液,加50%甲醇制成灵芝烯酸D浓度为131 μg/mL的对照品储备液。

内标溶液的制备:精密称取内标物地塞米松适量,加入适量甲醇制备成1.71 mg/mL对照品储备液,精密量取地塞米松对照品用50%甲醇稀释,得到质量浓度为855 ng/mL的内标溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

精密称取灵芝样品粗粉约1.0 g置具塞瓶中,精密移入50 mL的95%乙醇后进行提取具塞瓶称重,后超声处理(功率250 W,频率40 kHz)45 min,放冷之后提取具塞瓶再次称重,用提取的95%乙醇溶剂进行减失挥发重量的补足,摇匀,16900 r/min离心10 min,0.22 μm微膜滤孔滤过得到续滤液中按1∶1(200∶200 μL)加入内标溶液后进行测定。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量,用50%甲醇逐级稀释,加入地塞米松内标液,即得用于绘制线性曲线的不同浓度灵芝烯酸D对照液,按上述优化的超高效液相色谱以及三重四级杆质谱条件下检测,积分灵芝烯酸D的峰面积和内标地塞米松的峰面积。以灵芝烯酸D与内标峰面积比值(Y)对灵芝烯酸D的浓度(X)进行标准曲线的回归方程计算和线性相关系数r的计算,并以信噪比S/N≥10为定量限(LOQ),S/N≥3为检测限(LOD),结果得到灵芝烯酸D的回归方程为Y=0.0121X+0.0015(r=0.999 4),线性范围6.55～6550ng/mL,LOQ与LOD分别为6.55、1.97 ng/mL,表明在考察的浓度范围内,线性关系良好,符合定量分析要求。

2.3.2 精密度试验

取“2.2.1”项下对照品溶液,按照上述优化的超高效液相色谱以及三重四级杆质谱条件下检测6次,测得灵芝烯酸D与内标峰面积比值RSD为2.7%,表明仪器日内精密度RSD符合液相-质谱检测要求;连续3 d重复进样(n=3)测定,灵芝烯酸D与内标峰面积比值RSD为1.8%,表明仪器日间精密度RSD符合液相-质谱检测要求。

2.3.3 稳定性试验

取已经制备的S1批次的灵芝供试品溶液,分别于0、1、2、4、8、16、24 h按“2.1”项下色谱和质谱条件进样分析,测得不同时间段灵芝烯酸D与内标峰面积比值RSD为1.6%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4 重复性试验

精密称取同一批次(S1)福建灵芝药材样品6份,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,即取同批次样品约1.0 g置具塞瓶中,依法加入95%乙醇,制备样品溶液,并按照上述优化的超高效液相色谱以及三重四级杆质谱条件下检测,6份福建灵芝药材样品的灵芝烯酸D含量的RSD值为2.5%,结果表明,所建立的实验方法重复性试验符合液相-质谱联用分析要求。

2.3.5 加样回收率试验

精密称取“2.3.4”项下已测得含量的福建灵芝药材(S1)6份,约0.5 g,往6份平行样中精密加入0.0917 mg(近似1∶1)的灵芝烯酸D,按“2.2.2”项方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱和质谱条件进样分析,测定加标后测定量,并根据回收率公式计算灵芝烯酸D的回收率,见表2,灵芝烯酸D平均回收率为101.01%,RSD为2.6%,表明其回收率良好。

表2 灵芝烯酸D回收率测定结果

2.3.6 样品含量测定

取不同批次的赤芝样品约1.0 g置具塞瓶中,依法加入95%乙醇,分别制备各个产地灵芝检测样品溶液,并按照上述优化的超高效液相色谱以及三重四级杆质谱条件下检测,测定灵芝烯酸D的含量,结果见表3,福建、吉林、浙江、安徽四个产地灵芝烯酸D的含量对比见图3。

表3 各批次赤芝中灵芝烯酸D的含量(mg/g, n=3)

图3 福建、吉林、浙江、安徽四个产地灵芝烯酸D的含量对比

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

灵芝三萜酸是其独特生源途径下产生的主要药效物质成分,在进行色谱条件考察时,本实验考察了不同流动相体系包括考察了有机相色谱乙腈和色谱甲醇体系的对比,包括水相采用超纯水、0.1%甲酸水等比较,发现乙腈-0.1%甲酸水体系色谱峰峰型号较佳,响应较好,故确定为本实验的流动相体系。进一步进行灵芝烯酸D色谱条件优化,发现在灵芝烯酸D离子通道上存在4个同分异构体的色谱峰,并且质谱测试发现其在质谱条件上母离子和子离子相同,因此为使灵芝烯酸D能准确定量,必须对四个同分异构体进行拆分,确保四个异构体均能分别达到分离度1.5以上的良好分离,本实验优化了流动相的组成和梯度流动相洗脱的比例,进一步对乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)的比例进行优化,最终经过优化的0～9.5 min, 25%A; 9.5～11.5 min, 25%～31%A; 11.5～16.5 min, 31%A; 16.5～19 min, 31%～43%A条件下灵芝烯酸D能与另外3个同分异构体达到基线分离(分离度>1.5),符合定量分析要求。同时也提示福建灵芝中三萜类成分比较复杂,采用液相色谱测定时,往往难以达到基线要求。

3.2 质谱条件的优化

为了提高质谱检测的灵敏度,首先本文对比了正离子模式和负离子模式,发现正离子模式下灵芝烯酸D的响应优于负离子模式;进一步的实验对灵芝烯酸D的质谱多反应监测模式(MRM)进行优化考察,灵芝中的三萜酸化合物灵芝烯酸D与典型的灵芝酸A相比,主要区别在于侧链的20,22位形成双键,是一类弱极性化合物,在四环骨架中3、7、11和15位被羟基或羰基取代,易发生脱水(18 Da)、脱羧(44 Da)等裂解方式。在正离子模式下,灵芝烯酸D母离子为513.28,经过四级杆进行碰撞,其质谱裂解可以产生多个子离子如493.30 [M-H-H2O]-,467.28 [M-H-CO2]-,449.27 [M-H-H2O-CO2]-,437.23 [M-H-2CH3-CO2]-,其中子离子493.30 [M-H-H2O]-在质谱模式识别上表现丰度最高,经过碎片离子扫描模式(daughter scan)检测发现,子离子493.30 [M-H-H2O]-对比上述其他子离子,其峰面积也最大,因此将该离子493.30 [M-H-H2O]-作为定量子离子。本研究也进一步优化了锥孔电压Cone和碰撞能量CE,即采用不同的锥孔电压及碰撞能量对特定的定量离子对(513.3→495.3)进行考察,最终确定了本文使用的质谱条件。

3.3 含量测定结果分析

通过UPLC-QqQ-MS法测定不同产区中灵芝烯酸D的含量,其中福建灵芝的灵芝烯酸D的含量范围为0.1653～0.2013 mg/g,吉林赤芝的灵芝烯酸D的含量范围为0.0172～0.0839 mg/g,浙江赤芝的灵芝烯酸D的含量范围为0.0201～0.0608 mg/g,安徽赤芝的灵芝烯酸D的含量范围为0.0127～0.0389 mg/g。福建、吉林、浙江、安徽四个产地的含量均值分别为0.1801±0.0158、0.0444±0.031、0.0374±0.0176、0.0216±0.0117,经Student-t检验,福建灵芝的芝灵芝烯酸D含量显著高于其他3个产区,P值均小于0.001,从测定结果可以看出以灵芝烯酸D含量为0.1mg/g为限度,可以有效区分福建和其他不同产地灵芝,提示灵芝灵芝烯酸D的含量可作为福建灵芝质量溯源的重要成分。

综上所述,本研究通过UPLC-QqQ-MS法测定福建灵芝灵芝烯酸D的含量,方法简便、快速,可为福建灵芝的质量溯源提供可靠的实验依据。