河南省白灵侧耳菌株遗传多样性分析

孔维威 袁瑞奇 康源春 张玉亭 周舒浩 常晓超 刘洋洋

（河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所，河南 郑州 450002）

农业种质资源是保障国家粮食安全和重要农副产品有效供给的战略性资源。2020年，国务院办公厅出台“关于加强农业种质资源保护与利用的意见”，提出开展系统收集保护，实现应保尽保，要强化鉴定评价，提高利用效率等。2021年河南省农业农村厅印发《河南省农业种质资源普查总体方案》，计划利用3年时间在全省组织开展农业种质资源普查，摸清河南省农作物、畜禽、水产和食用菌种质资源家底。2019年河南省食用菌各类品种生产量折合55亿袋以上，鲜菇产量达到540.94万吨，产值397.70亿元，产量和产值继续居全国第一位[1]。出口创汇14.9亿美元，占2019年全省农产品出口额的69.63%[2]。

白灵侧耳（Pleurotus tuoliensis）[3,4]商品名为白灵菇，是我国具有自主知识产权和明确原产地的品种，也是最早被列入我国植物新品种保护名录（第六批）的食用菌品种（2005年5月20日农业部令第51号公布施行）。2019年全国白灵侧耳产量为5.7881万吨，比2018年增长3.67%[1,5]。白灵侧耳虽已人工栽培多年，但工厂化栽培菌株的农艺性状和商品性状还有待改进，原基诱导难、一致性低和生产周期较长是目前产业发展遇到的主要瓶颈问题。因此，加快选育白灵侧耳工厂化生产优良性状新品种是当务之急。

菌株遗传多样性是育种改良的基础。菌株遗传多样性分析的方法较多，张金霞等[6]研究发现白灵侧耳的IGS1区域较保守，菌株间没有多态性；IGS2区域较广、变异多，是种内遗传多样性分析和菌株鉴定的有效标记区域，IGS2结合限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析，准确性和可重复性好，是白灵侧耳种内遗传多样性和菌株鉴定鉴别的有效方法。本文广泛收集河南省内的白灵侧耳菌株32个，采用拮抗反应和IGS2-RFLP方法对其遗传多样性进行分析，以期为杂交选育白灵侧耳新品种的亲本选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料见表1。现保藏于河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所河南省食用菌种质资源库（Henan Mushroom Germplasm Resources Bank，HMGRB）。

表1 白灵侧耳供试菌株

1.2 方法

（1）拮抗反应。不同菌株间区别性鉴定采用拮抗法[7]。

（2）DNA提取。将低温保存的菌种连续活化2次后接种于PDA培养基平板上培养10天，然后使用孔径5 mm的打孔器打取10个菌种块转移至装有100 mL PD液体培养基的250 mL三角瓶中，25 ℃下150 r/min培养7天。10 000 r/min离心收集菌丝，液氮速冻后-80 ℃超低温冰箱保存备用。采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒（上海生工生物公司）提取DNA。

（3）IGS2-PCR。扩增体系采用2X高保真PCR Mix预混液（上海生工生物公司）和Primer各1.5µL，Template约25 ng，用ddH2O补齐至50 µL。上游引物：5'-ACTGGCAGAATCAACCAGGTA-3'，下游引物：5'-ACCGCATCCCGTCTGAT-3'。反应条件：94 ℃变性4 min；94 ℃变性1 min，56 ℃复

2 结果与分析

2.1 亲和性反应

不同菌株间存在拮抗反应，交界处菌丝一般呈现隆起型、沟型和隔离型3种反应类型。本试验结果表明，大部分白灵侧耳菌株间都为隆起型，少部分菌株间是沟型，极少数出现隔离型的现象。Pt1、Pt5和Pt22这3个菌株相互间无拮抗反应。

2.2 IGS2-PCR分析

由图1可知，应用IGS2片段的特异引物进行扩增，不同酶对供试菌株的IGS2-PCR产菌株间IGS2片段大小不同，数量在2～8条之间。

图1 白灵侧耳供试菌株IGS2-PCR扩增图谱

2.3 IGS2-RFLP及聚类分析

用HpaII、RsaⅠ和HaeIII等3个限制性内切物进行酶切，结果（图2）显示每个菌株均存在3种酶的酶切位点，但酶切位点不同，各菌株电泳后产生的带型图谱也不同。3种限制性内切酶酶切一共产生36个片段，其中有差异性的片段28个，占总带数的77.8%。采用最远邻法进行聚类分析，构建分子系统树（图3）。

图2 白灵侧耳不同菌株IGS2-RFLP 电泳图谱

图3 供试菌株的IGS2-RFLP聚类树状图

基于HpaII酶切的电泳图谱聚类分析结果为，在相对距离10下，可以将32个菌株分为3组，其中1、2、3、4、5、6、7、10、11、13、14、15、16、18、23、25、27、28、31、32号菌株为I组，9、17、19、20、22、24、26、29、30号菌株为II组，8、12、21号菌株为III组。基于RsaⅠ酶切和HaeIII酶切的电泳图谱聚类分析结果表明，这2个酶切后I组菌株与HpaII酶切的聚类结果完全一致，差别在于29号菌株是属于II组（RsaⅠ酶切），还是III组（HaeIII酶切）。组内各菌株的聚类关系也略有差异。

3 结论与讨论

目前我国已选育出一些白灵侧耳栽培种，其中通过国审的有4个品种。从子实体形态上主要分为掌状、扇状、匙状、马蹄状等。由于各单位引种途径不一，引种后又自行命名，造成名称比较混乱，在河南省尤为严重。IGS序列是核糖体RNA（rRNA）的重要组成元件，包括IGS（intergenic sparer）1和IGS2 这2个区域[8]。IGS序列的多态性研究发现，白灵菇和香菇不同菌株或不同品种之间存在多态性，可以用于菌株鉴别[6,9]。赵梦然等[10]比较白灵侧耳野生菌株的遗传多样性后发现，多态性检测效率最高的标记为ISSR，其次是IGS2-RFLP，最后是SCoT。3种标记中，SCoT和ISSR标记的聚类结果极其相似，均能较为准确地反映样本的地理来源；IGS2-RFLP的标记效率较高，准确性和可重复性好，可用于菌株标准图谱的制作，更适用于品种权保护中的菌株鉴定鉴别。

本研究共收集河南省内白灵侧耳菌株32个，应用拮抗反应和IGS2-RFLP法对这些菌株进行遗传多样性分析，结果发现大多数菌株间具有拮抗反应，仅Pt1、Pt5和Pt22等3个菌株相互间无拮抗反应。IGS2-RFLP法采用3种限制性内切酶，对白灵侧耳的IGS2扩增产物进行酶切，均具有良好的特异性、稳定性和可重复性，酶切图谱具丰富的多态性，不同菌株间有差异。基于上述结果对收集到的白灵侧耳菌株遗传多样性进行分析，最终将这些菌株分为亲缘关系较远的3组，其中25号（国审品种中农翅鲍）和32号（许白2号）菌株位于第I组，24号（国审品种中农1号）菌株位于第II组，其余菌株分属于三组之中。而菌株29号经3个酶酶切后的聚类分析分组位于第II组或第III组。此结论为今后新品种杂交选育亲本的选择提供参考和选择依据。