冷冻储藏对心肌力学性能的影响

杨阳，贾云超，荆腾，曾培，陆建飞，贺照明,3*

(1. 江苏大学国家水泵及系统工程技术研究中心，江苏 镇江 212013; 2. 江苏大学土木工程与力学学院，江苏 镇江 212013; 3. 德州理工大学机械工程系，美国 拉伯克TX79409)

心肌对心脏的跳动发挥着关键作用.心脏疾病是引起人类死亡最常见的原因之一，例如舒张性心力衰竭.研究发现心肌弹性成分的变化是引发该疾病的直接原因[1],所以认识健康和病态的心室行为是非常紧迫且重要的.当前，心脏领域关注的重点是构建计算模型以及研制仿生材料，以便更清楚地了解并治愈心脏疾病[2-3].因此需要对心肌组织的力学性能进行探究.研究常用的方法是对心肌组织进行双向拉伸来得到组织的力学特性.通常研究心肌的生物和力学性质会采取将心肌组织冷冻的方法来保证样本新鲜[4-5]，这是基于之前的研究者测试其他生物材料力学性质的结论[6-8].

目前，生物材料的力学特性是否会受到冷冻的影响还没有得出统一的结论.CHANGOOR等[6]对软骨组织进行冷冻试验，将冷冻至4 ℃的软骨组织存储6 d，对样本完成了机电测试和压缩试验，结果显示4 ℃下保存6 d的组织力学性能没有发生显著变化.然而，GIANNINI等[9]利用生物力学分析法研究了冷冻至-80 ℃腱索的生物力学性能后发现，与新鲜样本组相比，冷冻组的极限应力、载荷以及应变均降低，但在刚度上增强.总之，冷冻前后腱索的结构性质和生物性能均有显著的变化.另外，也有学者研究了如动脉[7]、主动脉组织[8]、皮肤[10]等生物组织的性能，其中部分研究的结论是新鲜组织与冷冻组织的力学性能没有发生显著变化[7-8]，但其他研究却得出相反的结论，即冷冻前后的组织性能如弹性模量或破坏应变显著变化[10].

已有对心肌性质的研究通常采取冷冻心肌的方法，这是基于其研究者测试其他生物材料力学性质的结论[6-8].然而，并没有学者真正研究过新鲜与冷冻心肌组织的性能，因此这种做法并不一定适用于心尖组织.文中详细探讨新鲜与冷冻心尖组织的力学性质.试验结果将有利于深入理解心尖组织的特定存储方式，并可为今后使用冷冻心尖组织的试验提供一定的参考.

1 试验材料和方法

1.1 双轴拉伸试验系统

计算机控制着步进电动机滑台运动，每个支架上的力传感器测量施加在样本上的平面内载荷，同时安装在样本正上方的工业相机以30 Hz的帧速监测着样本中心区域的形变.图1为双向拉伸心肌的原理图和实物图，图中FD为心肌组织的主要纤维走向，CFD为与主要纤维走向垂直的交叉纤维方向.

图1 双向拉伸心肌的原理图和实物图

1.2 样本准备

图2为样本获取位置和心尖切割实物.

图2 样本获取位置和心尖切割实物图

先从屠宰场获取新鲜健康的10个成年猪心脏，每个猪心重量在300～370 g内，随后立即转移到实验室.试验前，将猪心浸泡在生理盐水中，生理盐水可以抑制心肌组织受到兴奋、代谢等因素的影响.在猪心左心室较均匀光滑的位置获得试验所需的心尖样本，如图2a的黑色框线所示.利用模具控制所有样本的厚度和长宽，这样可以使得试验结果更加精准.规整后的样本长宽为30 mm，厚度为3 mm，切割心尖组织的方法如图2b所示.控制样本厚度为3 mm[1,11]可以在保证样本薄的同时尽可能避免在拉伸过程中样本出现撕裂的现象.样本4周使用3根4-0型号的缝合线将其固定安装在拉伸机上.另外，通过肉眼观察，判断样本主要的纤维走向[11].确保心肌的纤维方向与拉伸机的轴线x方向对齐，交叉纤维方向与装置的y方向对齐.另外，双向拉伸机下方简易的水浴装置可以让样本浸泡悬浮在生理盐水上，这样能保持样本的生理活性，并且减少因悬挂形成的自重.在样本的表面用黑色中性笔标记4个小黑点，在无应力状态下这些标记点处于样本1/3的中心区域，这样可以形成均匀的应变测量区域.设置步进电机的拉伸速率为100 mm/min，实验室室温为15 ℃左右，HUNTER等[12]研究表明生物组织的力学特性与应变速率无关，且当温度在5～37 ℃内，温度不会对生物组织性能产生影响.

1.3 双轴力学测试

为比较新鲜的与冷冻存储后的心肌样本的双轴力学特性，通过以下的步骤展开试验：① 双轴测试新鲜(控制)组样本；② 在-14 ℃下将样本冷冻48 h;③ 将冷冻过后的样本解冻并同样采用步骤①的方法，对该样本进行力学测试.力学测试对样本进行6次预加载处理，记录应力值，直至将其拉伸至15 kPa[13-14]的目标应力.预加载可以得到心肌样本的力学重复性，使试验更具说服力.当样本在15 kPa的应力下试验时，可以模拟在正常生理情况下心肌的载荷情况[13-14].预处理后，实行TFD∶TCFD=1.0∶1.0的等应力试验和TFD∶TCFD=0.5∶1.0,TFD∶TCFD=1.0∶0.5的不等应力试验，式中TFD为沿着样本纤维方向上的柯西应力，TCFD为交叉纤维方向上的柯西应力.所有试验方案均重复4次，每个试验方案在3次预处理后取第4次的应力作为最终的试验结果.所有的试验方案都在新鲜组织与冷冻样本上实施.

1.4 应力与应变分析

图3 等双轴拉伸分析的参数

1.5 统计分析

2 试验结果与分析

图4 新鲜与冷冻组织的峰值拉伸图

图5 预加载拉伸和力学拉伸图

图6为3种试验方案下心肌组织在高应力模量EHT，低应力模量ELT、延展性指数λ*和各向异性指数AI的统计分析比较.试验仅发现在TFD∶TCFD=1.0∶1.0的等应力拉伸下，交叉纤维方向上的低应力模量ELT有接近显著性差异p=0.056，其余参数均无统计学差异.值得注意的是，试验数据显示新鲜组织的延展性不如冷冻组织，且冷冻组织比新鲜组织的各向异性也略强.

图6 高应力模量EHT、低应力模量ELT、延展性指数λ*和各向异性指数AI图

3 讨 论

文中将心尖组织冷冻储存48 h后进行双轴拉伸测试，探究冷冻是否对心肌的力学性能产生影响.采用统计分析法对比10组新鲜样本和冷冻样本在TFD∶TCFD=1.0∶1.0,TFD∶TCFD=0.5∶1.0,TFD∶TCFD=1.0∶0.5的这3种拉伸方案下的应变数据，结果发现：所有的参数均无显著性差异，这显示48 h的冷冻贮藏对心尖的力学性质无显著性影响.

不同的解冻温度，可能会导致最终的试验结论不同.部分研究者发现样本在冷冻前后力学性能没有发生变化[7-8]，这与文中的试验结果一致.如DELGADILLO等[7]将冷冻至-20 ℃的动脉在4 ℃下解冻；SIOBHAN等[8]的样本在相对低温下解冻，这些结果都表明新鲜与冷冻样本的性质没有统计学差异.而如GIANNINI等[9]将冷冻的样本置于37 ℃的水浴中解冻，其得出的结论是冷冻后样本的力学性能发生了显著性变化.李波[15]使用气相色谱-质谱联用仪探究了温度对心肌的影响，试验发现温度的变化会让心肌降解成小分子的速率显著变快，因此过高的解冻温度会影响研究试验结果.文中建议在相对较低的温度下解冻样本.

冷冻存储样本的时长也可能会影响组织的力学性质.CHANGOOR等[6]的软骨冷冻试验显示：冷冻6 d软骨的力学性能无显著性变化，但冷冻12 d后的软骨无论在硬度还是力学性能上都有了明显的变化.未来可以研究冷冻时长对心肌力学性质的影响.

研究局限性：① 样本明确的冷冻速率是未知的.② 文中选取的是心尖部位，可能并不适用于心肌的其他部位.③ 本试验是在-14 ℃的冷冻温度，48 h 的冷冻时长下完成，不具有广泛代表性.④ 试验未对冷冻前后心尖的微观结构进行分析，缺少微观结构与宏观结构的系统分析.

4 结 论

1) 新鲜与冷冻组织的力学参数没有统计学差异.

2) 在文中特定的冷冻温度和时长下，冷冻不会对心尖部位产生影响.

3) 研究结果对后续采用冷冻系统来保存心尖组织研究有参考价值.