基于Box-Behnken 响应面法优化清香木叶的挥发油提取工艺优化

李文莉，马家宝，梁晓莲，赵凤仙，杨正腾

（1.广西中医药科学实验中心，南宁 530200；2.广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023；3.广西壮瑶药技术研究中心，南宁 530200）

清香木（Pistacia weinmannifolia）为漆树科黄连木属植物，别名紫油木、香叶树，细叶楷木等，喜光、耐干旱，分布于广西、四川、云南、贵州等地，生长于山坡、河谷地带［1］。清香木树根系发达、萌发力强、生命力旺盛，常用于石漠化治理及绿化改造［2，3］。在药用方面，该树具有芳香味，可驱逐苍蝇、蚊子等害虫，树叶具有消炎、解毒、收敛、止血的功效，常用于痢疾、肠道炎的治疗［4］。清香木叶挥发油中主要含有萜烯类、酮、酯、烷烃和醛类化合物，其中萜烯类化合物占绝大部分，使得其挥发油芳香气味浓郁，并具有消毒杀菌、抗肿瘤、抗氧化的作用［5-9］。目前，关于清香木叶的挥发油提取工艺方面鲜见报道，本研究利用水蒸气蒸馏法结合响应面分析法对清香木叶的挥发油提取工艺进行优化研究，为清香木的研究开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

清香木阴干叶子（广西万宝堂药业有限公司提供）；挥发油提取器（天津市德固特科技有限发展公司）；SXKW 型数显控温电热套（山海科恒实业发展有限公司）；PL203 型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；无水硫酸钠（天津市富宇精细化工有限公司）。

1.2 试验方法

参照2020 版《中国药典》一部的附录XD，采用水蒸气蒸馏法进行清香木叶挥发油的提取，然后用无水硫酸钠进行脱水干燥，保存［10］。最终挥发油提取得率按得到的挥发油重量与清香木叶原料重量的比值进行计算。

1.2.1 单因素试验

1）浸泡时间。分别准确称取5 份150 g 清香木叶于3 000 mL 圆底烧瓶中，加入2 000 mL 去离子水，按不同浸泡时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）浸泡清香木叶，提取5 h，比较不同浸泡时间对清香木叶挥发油提取得率的影响。

2）加水量。分别准确称取5 份150 g 清香木叶于3 000 mL 圆底烧瓶中，按不同加水量（6、8、10、12、14 倍）加入去离子水，浸泡2 h，提取5 h，比较不同倍数加水量对清香木叶挥发油提取得率的影响。

3）提取时间。分别称取5 份150 g 清香木叶于3 000 mL 圆底烧瓶中，加入2 000 mL 去离子水，浸泡2 h，按不同提取时间（3、4、5、6、7 h）进行提取，比较不同提取时间对挥发油提取得率的影响。

1.2.2 响应面试验设计 采用Box-Behnken 设计因素和水平，根据单因素试验结果，确定浸泡时间（A）、加水量（B）、提取时间（C）影响因素的水平，以清香木叶挥发油提取得率作为响应值，得出三因素三水平响应面试验设计，试验因素和水平见表1。

表1 清香木叶挥发油提取正交试验因素与水平

1.3 数据分析

根 据Design-Expert 8.0.6.1 软 件Box-Behnken 中心组合设计原理采用三因素三水平响应面法对清香木叶的挥发油提取工艺进行优化，以挥发油得率为响应值，对试验结果进行线性回归分析，以确定清香木叶挥发油的最佳提取工艺。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 浸泡时间对清香木叶挥发油提取得率的影响 由图1 可知，随着浸泡时间的升高，清香木叶的挥发油提取得率在一定范围内逐渐升高，这可能是因为药材与水充分接触需要足够的时间，浸泡时间足够，组织间隙就会增大，从而加快细胞内外液体的流动，最终使挥发油容易挥出，但当浸泡时间超过2.0 h 后，清香木叶与水分已充分接触，再增加浸泡时间提取得率变化也不明显。由此选择1.5、2.0、2.5 h 作为响应面浸泡时间设计的3 个水平。

图1 浸泡时间对清香木叶挥发油提取得率的影响

2.1.2 加水量对清香木叶挥发油提取得率的影响由图2 可知，随着加水量的增大，清香木叶挥发油提取得率也增大，当加水量增大到10 倍时，提取得率最高，因为挥发油是随着水蒸气而挥发的，当加水量很少时，水蒸气少，挥发油不能完全提取出来，另外加水量少也不能使药材完全浸透，容易发生糊化，提取得率降低，但加水量超过10 倍后，提取得率变化趋势不明显，可能是因为加水量太大，药液浓度过低，提取出来的挥发油浓度也相对较低，并且还有部分挥发油溶于水，不利于分离。因此，选择8、10、12倍加水量作为响应面设计的3 个水平。

图2 加水量对清香木叶挥发油提取得率的影响

2.1.3 提取时间对清香木叶挥发油提取得率的影响 由图3 可知，随着提取时间的增加，清香木叶挥发油提取率也增加，当提取时间增加到5 h 后，再增加提取时间提取率变化较小，说明当提取时间很少时，挥发油还不能完全从清香木叶中蒸出，当提取时间增大到一定程度后，挥发油基本可以从药材中蒸出，再增加提取时间提取得率几乎不变，而且还增加了成本。因此，选择4、5、6 h 作为响应面设计的3 个水平进行试验。

图3 提取时间对清香木叶挥发油提取得率的影响

2.2 响应面法优化清香木叶的挥发油试验设计与结果

采用响应面法，运用Design-Expert 8.0.6.1 软件对清香木叶挥发油三因素三水平的提取条件进行优化，响应值为挥发油提取得率（Y）。将试验结果进行线性回归分析，所得试验设计与结果见表2。

表2 清香木叶中挥发油Box-Benhken 试验设计与结果

2.3 响应面方差结果分析

由表3 可知，该回归模型P为0.002 1，小于0.01，失拟项P为0.179 9，大于0.05。表明该回归模型具有显著性，且该方程的拟合度相对较好，也具有相对较小的试验误差。在单因素中，A、B、C因素为极显著因素（P＜0.01）；在二次项中C2为极显著项，A2为显著项，B2项不显著；一次项交互作用只有AB为显著项，其他各项皆不显著。表明所选3 个因素浸泡时间、加水量及提取时间对清香木叶挥发油的提取得率具有显著影响。在3 个因素两两组合中，浸泡时间与加水量的组合对提取得率的影响显著，其余2 个组合影响不显著。拟合所得到的二次方程为

表3 清香木叶的挥发油提取试验响应面方差分析

Y=0.45+0.059A+0.051B+0.043C-0.038AB-0.015AC-0.020BC-0.042A2-0.032B2-0.060C2，相 关 系 数R2=0.935 6，说明该试验设计较显著、可靠。

2.4 因素间的交互作用

由响应曲面的弯曲程度和等高线的密集程度可以较好地分析各影响因素及因素之间的交互作用。由图4、图5、图6 可较直观地看出，清香木叶挥发油提取得率曲线最陡峭的为浸泡时间，表明其影响作用最显著，提取时间影响最不显著，表现为曲面平缓。通过对等高线进行分析，显示浸泡时间和加水量的交互作用等高线最密集，表明其对清香木叶挥发油提取得率影响最显著；而浸泡时间和提取时间的交互作用等高线最不密集，表明其对提取得率的影响最小。

图4 浸泡时间和加水量对清香木叶挥发油提取得率的影响

图5 浸泡时间和提取时间对清香木叶挥发油提取得率的影响

图6 加水量和提取时间对清香木叶的挥发油提取得率的影响

2.5 验证试验

通过Design-Expert 8.0.6.1 软件得到清香木叶的挥发油最优提取条件为浸泡时间2.23 h，加水量为10.93 倍，提取时间为5.22 h，提取率为0.481 2%。取3 份清香木叶按照上述最优提取工艺提取挥发油，得到清香木叶的挥发油平均提取得率为0.460 8%，与理论值相比降低了0.020 4 百分点，由此可以判断，该模型可较好地预测试验结果，具有较好的实际应用价值。

3 小结

常用的挥发油提取方法包括水蒸气蒸馏法、压榨法、溶剂法、微波萃取法、吸收法、二氧化碳超临界萃取法等［11］。其中，水蒸气蒸馏法因具有设备简单、操作安全、成本低等优点而成为植物挥发油提取最常用的方法。本研究以水蒸气蒸馏法对清香木叶挥发油的最佳提取工艺进行考察，选取浸泡时间、加水量、提取时间3 个工艺因素作为响应面参数水平，再利用Box-Behnken 响应面法进行试验设计与分析，该法与传统的正交设计相比较，模型预测性较好，分析方法更全面，更加接近实际情况。

清香木数量多、分布广泛，目前对其研究较多的是用于石漠化治理和园林绿化方面，但研究表明，清香木具有驱邪除恶、安神、定心、顺气止痛、温中利隔、固齿祛口臭、生津解渴的功效［1］，而清香木叶挥发油则具有抗菌抗肿瘤活性，对金黄色葡萄糖球菌、大肠杆菌、红酵母均具有较强的抑制活性［5，6，12］，并且在体外对肺部炎症也具有较显著的抑制作用［13］。本研究得出的清香木叶挥发油提取工艺为清香木的开发利用提供了参考依据。本研究运用响应面进行设计优化试验，建立回归方程，预测出水蒸气蒸馏法提取清香木叶的挥发油，提取工艺为浸泡时间2.23 h，加水量10.93 倍，提取时间5.22 h，提取得率为0.481 2%。在该条件下进行3 组平行试验，挥发油平均提取得率为0.460 8%，与预测值结果相差不大，说明优化的挥发油提取工艺可以较准确地筛选出清香木叶挥发油的提取工艺参数。