湖南腊肉中生物胺含量及品质分析

胡 鹏 周煌辉 陈光静 李安平

(1. 湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412012；2. 贵阳学院食品与制药工程学院，贵州 贵阳 550005；3. 中南林业科技大学，湖南 长沙 410004)

生物胺是一类含氮有机化合物的总称，是合成蛋白质、核苷酸、生物碱、荷尔蒙和芳香类化合物等的前体物质，在食品中广泛存在[1-3]。摄入少量的生物胺能提高免疫力、增强代谢活力、促进生长和清除自由基等，但是摄入含有高浓度生物胺的食物会对消费者的健康造成一定的风险，如引起头痛、心悸、呕吐、腹泻和高血压等[4-5]。组胺和酪胺是毒性最大的两种生物胺，分别可以导致“鲭鱼中毒”和“奶酪反应”的症状。“鲭鱼中毒”通常是因为食用金枪鱼、沙丁鱼、凤尾鱼、鲭鱼等鱼类导致的，表现为面部、颈部和上臂发红，口腔麻木、灼烧或者头痛、心悸、哮喘发作、荨麻疹、胃肠道症状以及吞咽困难。酪胺中毒称为“奶酪反应”，表现为偏头痛、心率加快、恶心、呕吐、呼吸紊乱和血糖升高[6-8]。其余生物胺，2-苯乙胺、腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、色胺摄入浓度过高时不仅会引起人体中毒，还可以抑制组胺和酪胺的代谢酶，从而增强组胺和酪胺的毒性[9]。尽管食用含有高浓度生物胺的食物会引起中毒，但目前对食物中生物胺的存在却没有统一的限量标准[10]。欧盟食品安全局对本地区发酵食品中生物胺进行了定量风险评估，规定水产品中组胺含量不得超过100 mg/kg，规定食品中酪胺含量不得超过100 mg/kg，美国FDA规定食品中组胺含量不得超过50 mg/kg[11]。生物胺根据化学结构，可以分为芳香族(酪胺和2-苯乙胺)、脂肪族(腐胺、尸胺、精胺和亚精胺)和杂环族(组胺和色胺)。

腊肉是腌腊制品中的典型代表和重要组成部分，是具有中国特色的一种传统发酵肉制品[12]。按照腊肉的生产地分类，可分为广东腊肉、四川腊肉、湖南腊肉等[13-14]。湖南腊肉是一种发酵肉制品，而发酵肉制品中的生物胺一直受到食用安全性的质疑，但是目前未见湖南腊肉制品中生物胺测定的研究报道[15-16]。研究拟采集湖南腊肉制品，采用高效液相色谱法测定湖南腊肉制品中的8种生物胺含量，并检测分析湖南腊肉制品中的水分含量、过氧化值和亚硝酸盐含量等理化指标，为评估湖南腊肉制品中生物胺安全风险及品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

腊肉制品：市售；

尸胺、色胺、腐胺、组胺、苯乙胺、精胺、亚精胺、酪胺、丹磺酰氯：纯度>98%，美国Sigma公司；

碳酸氢钠、氯化钠、氢氧化钠、硫代硫酸钠、亚铁氰化钾、碘化钾、三氯甲烷、冰乙酸、正己烷、氨水、石油醚、盐酸萘乙二胺、乙醇、乙醚、氢氧化钾：分析纯，上海麦克林有限公司；

对氨基苯磺酸、硼酸钠、硫酸铜：分析纯，天津市致远化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色仪：LC-20A型，日本岛津公司；

超声波清洗器：KQ5200B型，昆山市超声仪器有限公司；

电子分析天平：CPA225D型，德国赛多利斯科学仪器公司；

台式高速离心机：H1850型，湖南湘仪离心机仪器有限公司；

六孔水浴锅：HH-M6型，江苏新春兰仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液配制与柱前衍生 按孙霞等[17]的方法略做修改：准确称取色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺和亚精胺各50 mg，用0.1 mol/L盐酸定容到50 mL，并分别稀释制成终质量浓度分别为0.1，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，20.0，50.0 mg/L的混合标准溶液。取1 mL标准品混合溶液，加入200 μL NaOH(2 mol/L)，300 μL 饱和NaHCO3溶液，2 mL丹磺酰氯溶液(10 mg/mL 溶于丙酮)，混合均匀后在40 ℃黑暗中反应45 min，立即加入100 μL 25%氨水以终止反应，静置30 min 后用乙腈定容至5 mL，最后用0.45 μm的有机滤膜过滤，用于分析检测。

1.3.2 生物胺的提取 准确称取绞碎后的湖南腊肉5.0 g 于50 mL离心管中，加入0.4 mol/L的高氯酸(HClO4)20 mL，匀浆机上彻底匀浆，超声提取30 min，8 000 r/min离心10 min，将上清液转移至50 mL容量瓶中，沉淀部分再提取一次，将两次提取的上清液合并，再用0.4 mol/L的高氯酸(HClO4)定容至50 mL。移取上述样品提取液10 mL于50 mL具塞离心管中，加入10 mL正己烷，涡旋振荡3 min，静置分层后弃去上层有机相，再重复脱脂一次即可获得样品生物胺提取液。取1 mL样品提取液按标准溶液进行柱前衍生。

1.3.3 高效液相色谱分析条件 色谱柱使用Phenomenex Luna C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温35 ℃，紫外检测波长254 nm，高效液相色谱进样体积为20 μL，流速1.0 mL/min，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.3.4 理化指标测定方法

(1) 水分：按GB 5009.3—2016执行。

(2) 过氧化值：按GB 5009.227—2016执行。

(3) 亚硝酸盐：按GB 5009.33—2016执行。

1.4 数据分析

所有试验均重复3次，数据表示为平均值±标准差。使用SPSS Statistics 23软件进行数据的线性回归分析和相关性分析，结果采用Excel软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 生物胺标准品图谱和标准曲线

由图1可知，8种生物胺衍生物在25 min内全部出峰，分离效果好。其中，色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺的保留时间分别为9.607，11.734，12.492，13.516，14.192，18.369，19.311，23.356 min。

1. 色胺 2. 苯乙胺 3. 腐胺 4. 尸胺 5. 组胺 6. 酪胺 7. 亚精胺 8. 精胺

由表2可知，在0.1～50 μg/mL范围内8种生物胺的质量浓度与峰面积的线性关系良好，其R2均在0.999 1以上。重复测定8次生物胺标准品，8种生物胺RSD均低于4.0%，表明具有良好的重复性。

表2 标准曲线的回归方程、R2及精密度

2.2 市售湖南腊肉样品中生物胺的种类和含量

由表3可知，8种生物胺中，仅色胺、尸胺2种生物胺在湖南腊肉部分样品中未检出。色胺含量的变化范围为ND～8.46 mg/kg，苯乙胺含量的变化范围为10.71～17.21 mg/kg，腐胺含量的变化范围为15.37～40.59 mg/kg，尸胺含量的变化范围为ND～80.36 mg/kg，组胺含量的变化范围为0.43～10.24 mg/kg，酪胺含量的变化范围为2.11～57.60 mg/kg，亚精胺含量的变化范围为1.53～6.79 mg/kg，精胺含量的变化范围为11.17～39.47 mg/kg，生物胺总量在腊肉中的含量范围为127.22～166.24 mg/kg。

表3 湖南腊肉样品中的生物胺含量†

由图2可见，6种湖南腊肉样品中尸胺的平均含量高于其他生物胺的，而色胺的最低。尸胺、腐胺、精胺、酪胺是湖南腊肉中的主要生物胺。组胺是8种生物胺中毒性最强的。欧盟规定除鱼类外其他食品中组胺含量不得超过100 mg/kg[18]；美国食品和药品监督局确定食品中组胺含量应低于50 mg/kg[19]。湖南腊肉中组胺平均含量为4.84 mg/kg，在样品中组胺范围为0.43～10.214 mg/kg，其含量远低于欧盟和美国食品和药品监督局的规定。酪胺是目前认为毒性仅次于组胺的生物胺。欧盟规定酪胺在食品中的限量为100 mg/kg[18]，在所检样品中酪胺均低于100 mg/kg。苯乙胺目前还没有相应的限量标准，但有研究[20]表明苯乙胺超过30 mg会引起偏头痛的反应。试验采集的样品中苯乙胺含量均低于30 mg/kg。Lu等[21]对中国的传统中式香肠中生物胺进行了调查，发现酪胺、腐胺和尸胺是主要的生物胺，在香肠中14.28%的样品生物胺总量超过美国食品和药品监督局规定的限量标准(1 000 mg/kg)，57.14%的样品中酪胺的含量超过美国食品和药品监督局规定的限值(100 mg/kg)，11.9%的样品中组胺含量超过美国食品和药品监督局规定的限值(50 mg/kg)，28.5%的样品中苯乙胺含量超过30 mg/kg。孙霞等[17]研究了四川30种市售四川发酵香肠，发现尸胺、组胺、酪胺、腐胺是主要的生物胺，80%的样品中组胺超过100 mg/kg，73%的样品中酪胺的含量超过100 mg/kg，10%的样品中生物胺总量超过1 000 mg/kg，76%的样品中苯乙胺含量超过30 mg/kg。试验结果与上述研究结果不同的原因可能与生产原料、发酵方法、加工条件以及生产工艺等有关。

图2 腊肉中不同生物胺平均含量的比较

由图3可知，不同湖南腊肉样品中生物胺总量有差别但不大。有研究[22]表明，食品中生物胺总量大于1 000 mg/kg 会对人体造成损害。由图3可知，所有腊肉样品中生物胺总量均低于1 000 mg/kg。因此，食用湖南腊肉不会引起不良反应。

图3 不同腊肉样品中生物胺总量

2.3 理化指标

2.3.1 水分含量 由图4可知，湖南腊肉样品中水分含量检出范围为13.4%～22.4%。水分含量与微生物生长密切相关，水分含量高，微生物生长活动旺盛，在微生物作用下，游离氨基酸容易产生生物胺。所检样品水分含量在13%～23%，水分含量适中，对微生物生长有抑制作用，不利于生物胺的生成。

图4 腊肉样品中水分含量

2.3.2 过氧化值 过氧化值可衡量油脂酸败程度，其值越高腊肉制品酸败越严重。由图5可知，湖南腊肉样品中过氧化值范围为0.014 2～0.035 0 g/100 g。GB 2730—2015《食品安全国家标准 腌腊肉制品》规定腊肉中过氧化值不超过0.50 g/100 g。因此，试验样品的过氧化值均符合国家标准。

图5 腊肉样品中过氧化值

2.3.3 亚硝酸盐 由图6可知，此次检测的样品中，所有被检湖南腊肉制品均检出了亚硝酸盐，检出率为100%，检出范围为2.15～7.50 mg/kg。GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》规定腊肉制品亚硝酸盐残留量不能超过30 mg/kg，所检样品均符合此标准要求。王新惠等[23]调查了四川腌腊肉制品中的亚硝酸盐超标情况，发现15份样品中，亚硝酸盐残留量远低于30 mg/kg，合格率100%，与试验得出的结论一致。亚硝酸盐可以与尸胺、腐胺反应生成致癌物质亚硝胺，并能增强生物胺的毒性风险。因此必须严格控制亚硝酸盐的含量，确保消费者的健康。

图6 腊肉样品中亚硝酸盐含量

马艳莉等[24]研究了白方腐乳开盖后贮藏过程中生物胺和理化指标的变化，发现pH与苯乙胺呈显著正相关，与其他生物胺之间呈弱相关，氨基态氮与苯乙胺、尸胺、组胺呈显著正相关。吴训忠等[25]研究了发酵辣椒中生物胺含量及其品质，表明生物胺含量与氨基酸态氮、总酸、还原糖含量之间未发现较强相关性。曾雪晴等[26]研究了市售郫县豆瓣酱中生物胺与理化性质的相关性，发现郫县豆瓣酱中生物胺含量与pH和总酸间没有较强的相关性，只呈弱的相关，与盐及氨基态氮含量间无相关性。试验中湖南腊肉理化指标水分含量、过氧化值、亚硝酸盐与生物胺含量之间的相关性不显著，目前研究认为氨基酸态氮含量与生物胺含量之间可能存在一定关联，尚需进一步研究。

3 结论

采用丹磺酰氯衍生，高效液相色谱—紫外检测湖南腊肉制品中生物胺的含量，8种生物胺在25 min内良好分离。测定结果显示，湖南腊肉制品中尸胺、腐胺、精胺、酪胺是主要的生物胺，生物胺总量在127.22～166.24 mg/kg。组胺含量低于50 mg/kg，酪胺含量均低于100 mg/kg。湖南腊肉生物胺含量均低于限定标准，在食用的安全水平之内。理化指标方面，样品水分含量适中(13%～23%)，过氧化值和亚硝酸盐均符合国家标准要求。研究中生物胺含量与水分、过氧化值、亚硝酸盐之间未发现较强相关性。湖南腊肉中生物胺的形成受多种因素的影响，要确定生物胺形成的具体原因，还需要进一步研究氨基酸态氮和微生物对腊肉生物胺生成的具体影响。