超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术分析地芬尼多代谢产物

王 灵，侯建平

（巴中市公安局，四川 巴中636000）

地芬尼多( difenidol) 又名二苯哌丁醇，属于芳烃类药物，为 H1 受体拮抗剂，可以改善脑椎动脉循环、扩张痉挛血管、调节前庭神经系统，并具有抗呕吐作用，常作为晕车药使用[1]。由于地芬尼多属于非处方药物，容易获取，在自杀和误服案事件中较为常见[2-3]。

目前在地芬尼多的检测报道中，大多是基于气相色谱、气相色谱-质谱联用仪、高效液相色谱和高效液相色谱质谱法[4-8]对地芬尼多母体的检测，而关于地芬尼多血液中代谢产物的检测报道甚少，难以满足法医学鉴定及临床检测对代谢产物的鉴定需要。高分辨质谱在药物体内检测和代谢鉴别方面有广泛的应用[9-11]，本研究采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用法（UPLC-HRMS）分析中毒人员血液中地芬尼多可能产生的代谢产物，并对这些代谢产物的结构和二级碎片离子进行研究。在现有地芬尼多检测方法中加入代谢产物，为地芬尼多中毒死亡案例和临床中毒患者的快速检验提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

Q Exactive超高效液相色谱-质谱联用仪，配备HESI源、高压二元泵、自动进样器、柱温箱、在线脱气机（Thermo Fisher Scientifi c， 德国）；Xcalibur 2.2软件（Thermo Fisher Scientifi c， 美国）。

地芬尼多标准品（中国药品生物制品检定所）；乙腈、甲醇（色谱级，Tedia 公司，美国）；甲酸（液质级别，Thermo Fisher Scientifi c，美国）； 其他试剂均为国产分析纯。

1.2 标准溶液配制

精确称取地芬尼多标准品适量，用甲醇配制成 1 mg/mL标准样品储备液，再用甲醇稀释配制成标准工作溶（1 μg/mL）备用。

1.3 样品前处理

取服用盐酸地芬尼多过量致死者的心血0.1 mL于一次性离心试管中，加入0.3 mL乙腈，涡旋振荡混匀，10 000 xg/min离心10 min， 取上清液过0.22 μm尼龙滤膜（天津艾杰尔公司）后，置进样瓶中，供UPLC-HRMS分析。

1.4 UPLC-HRMS分析条件

1.4.1 液相条件

色谱柱： Waters BEH C18 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：0.1% 甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～2 min，90% A；2～12 min；90% A → 10% A ；12～14 min，10% A ；14～15 min，10% A → 90% A）；流速：0.3 mL/min；柱温： 40 ℃ ；进样量 ：2 μL。

1.4.2 质谱条件

HESI 源，采用正离子扫描模式，喷雾电压3.5 kV，毛细管和雾化器温度分别为250和350 ℃。鞘气和辅助气压力分别设为275.8和103.4 kPa，S-lensRF电压60 V，喷雾气和碰撞气均为氮气。使用正电离校正液对质谱质量轴进行校正，每7 d校正1次。扫描方式Full MS/dd-MS2模式，此模式包含一级准确分子量全扫描（分辨率 70 000 FWHM）和数据依赖的二级子离子扫描（分辨率 17 500 FWHM）。一级全扫描范围为m/z50～500，自动增益控制（AGC）和离子注入时间（IT）分别为 1.0e6 和 100 ms，数据依赖的二级扫描（dd-MS2）AGC 设为2.0e5，最大IT设为50 ms， 同位素隔离窗口宽度（isolation window）设为1.0m/z，相对阈值（intensity threshold）设为1.0e5。

2 结果与讨论

2.1 UPLC-HRMS分析结果

通过UPLC-HRMS检测，采用数据处理软件进行代谢产物分析。推测出可能存在的代谢产物代谢途径见图1，三种可能代谢产物具体信息见表1。对可能为代谢产物的化合物，根据羟基化和脱水等代谢途径及碎片离子信息分析其结构及分子式。

2.2 代谢产物推测

地芬尼多的分子式为C21H27NO，其[M+H]+的m/z理论值为310.216 5，根据标准品进样后得到地芬尼多及代谢产物的选择离子色谱图（图2）与碎片离子图（图3），一级母离子离子流色谱图（图2a）和二级碎片谱图（图3a）与样品中M的一级母离子选择离子流色谱图（图2b）和二级碎片谱图（图3b）相匹配，且保留时间分别为7.54和7.63 min，推导出化合物M为地芬尼多。地芬尼多二级碎片离子谱 图 中，m/z为 91.054 5、129.069 7、181.101 0和207.116 4的碎片离子是其特征碎片离子，其可能的结构见图4所示，根据这些特征离子对其可能存在的代谢产物进行二级碎片比对鉴别。

通过分析，地芬尼多在血液中可能存在羟基化代谢产物M1、脱水代谢产物M2和先脱水后苯环羟基化的代谢产物M3。M1可能为羟基化产物[M+O]，推测分子式为C21H27NO2，其[M+H]+的m/z理论值为326.211 4，与地芬尼多母离子m/z310.216 5差16Da为O原子。根据以上信息在原始数据中对326.211 4进行一级母离子提取选择离子流色谱图，质量误差设置为5 ppm ，得到图2c中色谱峰，对其进行二级碎片离子提取后得到图3c。从图3c可见91.054 6、129.069 7碎片与地芬尼多碎片相同，但是缺少了181.101 0和207.116 6碎片，增加了197.095 4和223.111 1碎片。推测产生的原因是代谢产物M1在地芬尼多母体结构上增加了一个羟基，两个增加的碎片符合[M+OH]，且整体质荷比符合图4中e和g结构。推测223.111 1和197.095 4碎片的可能结构见图4e、g，为在181.101 0和207.116 6碎片基础上增加一个羟基，其m/z差值也符合预测，综合以上碎片信息，分析出代谢产物M1可能的分子结构见图4a。

地芬尼多在体内还可能发生脱水反应[M-H2O]，推测分子式为C21H25N，其[M+H]+的m/z的理论值为292.205 5,与地芬尼多母离子m/z310.216 5差18Da为脱H2O。根据以上信息在原始数据中对292.205 5进行一级母离子提取选择离子流色谱图，质量误差设置为5 ppm，得到图2d中色谱峰，对其进行二级碎片离子提取后得到图3d。从图3d中可见m/z为91.054 6、129.069 7、181.099 9和207.116 9的碎片离子，与地芬尼多碎片离子一致，分析出代谢产物M2可能的分子结构见图4d。

在代谢产物M2的基础上，还会继续在产物M2的苯环上发生羟基化反应[M+O]，推测分子式为C21H25NO，其[M+H]+的m/z的理论值为308.200 7，与M2母离子m/z292.205 5差16Da为加O。在原始数据中提取308.200 7的一级母离子色谱图，质量误差设置为5 ppm，得到图2e中色谱峰，对其进行二级碎片离子提取后得到图3e。从图3e中可见m/z为91.054 6、129.069 7、197.095 4和223.111 1的碎片离子，与M1代谢产物碎片相同，其归属信息在前文已有推论，分析出代谢产物M3结构见图4c。

3 结论

运用UPLC-HRMS技术，可以从复杂的血液样品中获取更多目标物和代谢产物的色谱质谱信息，尤其是在母体化合物基础上极性增加的代谢产物。本文利用高分辨质谱信息，通过与标准品的质谱碎片信息比对，同时与其他研究文献进行对比[12]，分析了不同的代谢途径下可能的代谢产物及其碎片离子，推测出了中毒人员血液中三种代谢产物。地芬尼多在中毒人员血液中的主要代谢途径包括羟基化和脱水。本文首次利用UPLC-HRMS技术对地芬尼多体内代谢产物进行了分析，为后期地芬尼多中毒案事件检验和新代谢产物的鉴定提供了参考。