不同浓度FSH对上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及分子机制研究

路晓琳，郝娜，成艳梅

上皮性卵巢癌是卵巢恶性肿瘤中发病率最高的一类肿瘤，由于其早期多无明显症状，不易被重视，导致其总体预后较差，5年生存率较低，死亡率占各类妇科肿瘤首位[1]。目前关于卵巢癌的病因和发病机制仍不明确，有研究认为，雌激素分泌增多对卵巢上皮细胞有刺激作用，可能增加了患卵巢癌的风险[2]。卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)是一种由脑垂体合成并分泌的糖基化蛋白质激素，能够促进卵泡成熟，与黄体素共同作用还能促进雌激素分泌，在卵巢癌发生发展中发挥着重要的作用，因此通过测定FSH值，可以间接判断卵巢的功能状态[3-4]。有研究报道，FSH受体在正常或炎性组织的脉管系统中表达较少，但在人类恶性肿瘤的血管内皮细胞中呈现高表达，可作为恶性肿瘤诊断和治疗的潜在靶标[5]。另有研究发现，FSH和上皮性卵巢癌的发生进展密切相关，能够诱导卵巢癌细胞增殖，抑制癌细胞凋亡，其调控机制可能与PI3K/AKT途径有关，除该通路之外，FSH与卵巢癌之间是否还存在其它介导关系还需进一步研究[6-7]。本研究着重分析不同浓度FSH对卵巢癌细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学功能影响，进而更深入地探讨FSH能否通过ERK通路对卵巢癌的发生发展起到调控作用。

1 材料及方法

1.1 实验材料

SKOV3和OAW28细胞(购自中国科学院细胞库)；FSH(购自美国Sigma公司)；胎牛血清、Mc-Coys 5A培养基、RPMI1640培养基(均购自Gibico公司)；MTT试剂盒(购自上海避碧云天生物技术有限公司)；Transwell小室(购自美国Invitrogen公司)；细胞培养箱、酶标仪(购自Thermo公司)；倒置显微镜(购自Nikon公司)；流式细胞仪(购自美国Beckman-Coulter公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 SKOV3细胞用10%胎牛血清配置的Mc-Coys 5A培养基；OAW28细胞用10%胎牛血清配置的RPMI1640培养基；两种细胞均培养于37℃，5% CO2孵育箱中，用80%的细胞密度进行传代，待细胞长至取对数生长期后，进行后续实验。

1.2.2 细胞生长状态观察 分别取SKOV3和OAW28细胞接种于有盖玻片的培养基中，待细胞贴壁后分别加不同浓度的FSH(0，20，40，80 IU/L)，继续培养48 h后，在显微镜下观察各组细胞生长状态。

1.2.3 MTT观察SKOV3和OAW28细胞增殖能力 分别取对数生长期的SKOV3和OAW28细胞，接种于96孔板中，加入含不同浓度FSH的培养液，每组设5个复孔，在37℃ 5% CO2孵育箱分别培养24、48、72 h后，吸出含药培养基，加灭菌后的MTT液20 μL,继续孵育4 h后取出，加入DMSO微微震荡溶解，用酶标仪在波长570 nm处测其吸光值(A)，并计算增殖指数=AFSH不同浓度组/A对照组×100%。

1.2.4 流式细胞仪检测SKOV3和OAW28细胞周期变化 分别取对数生长期的SKOV3和OAW28细胞，加入含FSH不同浓度的培养液继续培养48 h，经胰蛋白酶消化后，3 000 rpm离心5 min，收集全部细胞至1.5 mL离心管，用事先预冷的PBS缓冲液洗涤2次后，加入预冷的75%乙醇，4℃条件下固定5 h，再经1 500 rpm离心5 min，收集细胞，用PBS润洗一次，加入400 μL PI染液，室温避光孵育30 min，用流式细胞仪进行检测细胞凋亡和周期变化，每组设3个复孔。

1.2.5 Transwell实验检测SKOV3和OAW28细胞侵袭能力 将Transwell放入培养板中，在上室加入Matrigel基质胶，37℃ 30 min形成基质膜，然后将FSH不同浓度培养的SKOV3和OAW28细胞接种于Transwell上室，在下室加入500 μL 20% FBS细胞培养液，置于37℃ 5% CO2培养箱中孵育24 h，取出Transwell小室，弃去培养板中的培养液，用棉签擦拭上层未迁移的细胞，用PBS清洗下层细胞3次，用乙醇固定30 min，适当风干后用0.1%结晶紫染色20 min，PBS清洗，倒置晾干后在光学显微镜下随机选取5个高倍视野进行细胞计数，数量越多则侵袭能力越强。

1.2.6 Western blot检测不同浓度卵泡刺激素对ERK通路蛋白表达的影响 分别取对数生长期的各组细胞，加入细胞裂解液充分裂解后，在 4℃，12 000 r/min的条件下进行离心取上清液，用BCA试剂盒检测各个样品中蛋白的浓度。若蛋白浓度相差过大，需要将样品的蛋白浓度调至一致。将调整后的样品加入loading buffer，混匀后煮沸10 min，恢复至室温后离心，配置8%分离胶，在分离胶上面距顶端3 cm处加入浓缩胶，加入蛋白样品后，80 V浓缩，120 V分离，电泳结束后转NC膜2 h、脱脂奶粉室温封闭2 h、PBST洗膜、加入一抗4℃孵育过夜，PBST洗膜三次后加入二抗，室温孵育2 h，PBST漂洗3次后采用化学发光法进行显色，凝胶成像仪观察拍照，并用Image-J 软件分析各组蛋白相对表达。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 不同浓度卵泡刺激素对SKOV3和OAW28细胞生长状态影响

通过倒置显微镜观察，SKOV3和OAW28细胞经不同浓度FSH处理后大部分细胞贴壁生长，状态良好，只有少数细胞由棱形皱缩成圆形，呈悬浮状态；与FSH空白组相比，加有FSH组的细胞密集度明显增加，40 IU/L的时候细胞密度最大，见图1。

图1 不同FSH浓度对SKOV3和OAW28细胞生长状态影响

2.2 不同浓度卵泡刺激素对SKOV3和OAW28细胞增殖能力的影响

MTT细胞增殖实验表明，与空白组(0 IU/L)相比，不同浓度FSH作用于SKOV3和OAW28细胞24，48，72 h后，其增殖能力明显增强(P<0.05)，在FSH浓度为40 IU/L作用48 h后，两种细胞的增殖指数均达到最大，当浓度达到80 IU/L时，虽然也促进癌细胞增殖，但增殖指数较40 IU/L略有下降，详见表1和表2。

表1 不同浓度FSH作用于SKOV3细胞的增殖指数比较(%)

表2 不同浓度FSH作用于OAW28细胞的增殖指数比较(%)

2.3 不同浓度卵泡刺激素对SKOV3和OAW28细胞凋亡及周期的影响

流式检测结果表明，FSH对SKOV3和OAW28细胞的凋亡起到了明显的抑制作用，且在浓度为40 IU/L作用48 h，凋亡率最小(P<0.05)，详见下页表3；不同浓度的FSH对SKOV3和OAW28细胞细胞周期变化也有显著影响，随着FSH浓度增大，两种细胞G0/G1期百分比随之下降，S期和G2/M期百分比逐渐上升，SKOV3细胞在40 IU/L时有显著差异，OAW28细胞在20 IU/L时开始有明显差异，但在40 IU/L时变化最大(P<0.05)，详见下页表4。

表3 不同FSH浓度作用下SKOV3和OAW28细胞的凋亡率(%)

表4 不同FSH浓度作用下SKOV3和OAW28细胞周期变化(%)

2.4 不同浓度卵泡刺激素对SKOV3和OAW28细胞侵袭能力的影响

Transwell实验表明，与不含FSH的空白组相比，不同浓度FSH均可以促进SKOV3和OAW28细胞侵袭，有统计学差异(P<0.05)，并且在FSH浓度为40 IU/L作用48 h时，两种细胞的侵袭能力达到最强，当浓度达到80 IU/L时虽然仍有促进作用，但较40 IU/L略有减弱，见下页图2和图3。

图2 不同浓度卵泡刺激素对SKOV3细胞侵袭能力的影响图3 不同浓度卵泡刺激素对OAW28细胞侵袭能力的影响

2.5 不同浓度卵泡刺激素对ERK通路蛋白表达的影响

Western blot结果表明，与FSH空白组相比，含有FSH的各组细胞中Ras，Raf蛋白表达水平显著增加，使得MEK和ERK1/2磷酸化水平被活化，并且表达水平与FSH呈浓度依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)，见下页图4和图5。

图4 不同卵泡刺激素浓度对SKOV3细胞中ERK通路蛋白表达的影响

图5 不同卵泡刺激素浓度对OAW28细胞中ERK通路蛋白表达的影响

3 讨论

由于卵巢癌早期患者缺乏明显症状，诊断时往往已经发展至中晚期，导致错失最佳治疗时间，并且卵巢因其位置深入盆腔，在行根治手术时不易彻底清除，术后复发率高，严重威胁着人类的健康[8]。因此，探究介导卵巢癌发生发展的信号通路，阐明其调控机制，对于临床治疗卵巢癌具有十分重要的意义。有研究报道，由于FSH受体在卵巢肿瘤中过度表达，在近几年已经将FSH作为卵巢癌的成像生物标记物；此外还证实FSH受体参与介导癌症进展和转移的信号级联反应，靶向FSH受体不仅可以作为卵巢癌，而且还可以作为许多其他人类实体癌的介入探针[9-10]。Liu XM等[11]通过建立FSH作用于HO8910和SKOV3两种细胞模型，证实FSH 通过促进细胞周期时相变化促进卵巢癌细胞增殖，且当 FSH受体呈阳性时，细胞周期变化更明显。Yan XN等[12]从分子水平探索了FSH通过PI3K/Akt途径对上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响，结果发现FSH对卵巢癌细胞具有促增殖和抗凋亡的作用，可能是FSH与上皮细胞中的受体结合，激活了PI3K/AKT通路，导致突变型p53发生同向变化，诱导细胞进入增殖周期，而不能及时凋亡，加快了卵巢癌的发生。本研究发现，FSH可以促进卵巢癌SKOV3和OAW28细胞增殖和侵袭，诱导细胞从G1期向S期和G2期发展，加快了有丝分裂进程，抑制细胞发生凋亡，从而引起细胞恶性繁殖，对卵巢癌的发展起到了催化作用，与前期文献报道结果相吻合。

Ras/Raf/MEK/ERK通路是学术界公认的介导肿瘤增殖、分化和细胞存活的经典信号通路，它与PI3K/AKT通路一样，在肿瘤生物学过程中发挥重要作用[13]。有研究报道，Raf/MEK/ERK途径对各种谱系细胞的生长，细胞凋亡的预防，细胞周期阻滞和耐药性的诱导具有不同的作用，例如Raf/MEK/ERK可能会促进前列腺细胞的细胞周期停滞，这可能受到p53的调节，因为p53缺陷的前列腺癌细胞中野生型p53的恢复导致它们对化疗药物的敏感性增强，因此在晚期前列腺癌中，诱导Raf/MEK/ERK表达以促进细胞周期阻滞可能是有利的；而在造血系统癌症中，抑制Raf/MEK/ERK诱导的增殖和耐药性可能是有益的[14]。另有研究探索了MEK/ERK通路在肝细胞癌发生中的重要作用，结果发现索拉非尼可以降低HepG2 和HCC细胞中MEK和ERK磷酸化水平，减少肿瘤微血管生成，产生完全的肿瘤生长抑制作用[15]。此外，还有研究发现，当肺癌细胞受到外界刺激后，则会导致Ras作用位点发生突变，持续处于激活状态，活化的Ras不断招募细胞浆内Raf蛋白至细胞膜上，进而诱导MEK和ERK蛋白磷酸化，造成癌细胞不可控制地增殖、恶变，同时细胞凋亡数量减少，间接加速了癌症的发展进程[16]。基于上述文献发现，Ras/Raf/MEK/ERK途径确实参与了多种癌症的发生发展，但在不同癌症中的作用机制也不尽相同，本研究着重探讨了FSH介导Ras/Raf/MEK/ERK途径对卵巢癌增殖、凋亡的影响，结果表明FSH可以上调SKOV3和OAW28细胞中Ras，Raf，p-MEK和p-ERK蛋白表达，活化ERK通路，通过促进细胞周期转变来诱导卵巢癌细胞增殖，抑制卵巢癌细胞凋亡，为后期卵巢癌的临床治疗提供了基础实验依据。

综上所述，不同浓度的FSH可以促进卵巢癌SKOV3和OAW28细胞增殖，诱导细胞周期从G1期向S期和G2期转变，抑制细胞凋亡，其调控机制可能与活化Ras/Raf/MEK/ERK信号通路有关。但本研究还存在一定的局限性，后期可以通过动物实验观察体内注射FSH对卵巢癌组织的影响，并进一步验证该调控机制是否与细胞实验相一致。