水产品中孔雀石绿检测方法分析

王雪 潘发林 赵莹

孔雀石绿也称为碱性绿，具有一定的杀菌作用，用其可以对鱼类中的鱼卵寄生虫等一系列真菌进行处理，以此避免细菌感染问题的发生。但是此类物质自身具有高毒性，可以在鱼的体内达成高残留，一般情况下残留会达到100d以上，如果含量过大，甚至还会出现相对应的突变副作用，导致畸形。我国有关部门针对此类问题提出了相应的策略，从而减少其对于人体的伤害。在此过程中，我国研究出了多种孔雀石绿检测方式，但是每种检测方法都各有利弊，研究人员需要结合实际情况合理作出判断，从而选择合适的检测方法。

一、孔雀石绿的特性和危害

孔雀石绿可以被当作三苯甲烷类染料，其化学别名为四甲基代二氨基三苯甲烷，此类物质进入动物体内后会加快新陈代谢，并且整体代谢物可以形成脂溶性的无色孔雀石绿。针对此类问题，我国研究人员通过研究后选择利用药浴的方式进行处理，药浴一般保持在24h内。在药浴开始6h后，鱼的体内逐步排出了孔雀石绿的残留物，并且此时的孔雀石绿残留达到高峰;药浴处理72h之后，鱼体内的孔雀石绿被排出90%，全部排出则需要720h。实验还发现，在将近2000h后，鱼的体内不会再出现孔雀石绿。上述测试针的是有色孔雀石绿，对于无色孔雀石绿而言，在药浴72h后，可以达到相应的巅峰值，后续鱼自身的代谢逐渐缓慢;到了720h后，鱼的代谢可以保持在50%左右，2000h之后进行检测，鱼体内不再含有孔雀石绿。

对于当前我国的水产养殖工作而言，孔雀石绿一般被用于消杀寄生虫，还可以通过使用孔雀石绿减缓鱼出现烂鳃病的情况。由于孔雀石绿自身价格低廉并且效果较好，因此被广泛应用于水产养殖。但是，孔雀石绿自身具有较强的致癌物质，还会导致突变问题，因此在水产养殖方面需要进行高效管控，确保动物体内的孔雀石绿含量在规定范围内。对此，全球很多国家都出台了相应的规范要求，甚至很多国家还对此类药物进行了禁用。近年来由于我国多个城市出现孔雀石绿超标问题，严重影响了我国水产品出口业务，为了杜绝此类事件的发生，科研人员进行了深入探讨，以便确保水产品的孔雀石绿含量在可控制的范围内。

二、准备材料

1.仪器和试剂。（1）仪器。电子分析天平、电子天平、高速冷冻离心机、酸度计、超声波清洗仪、涡旋混合器、固相萃取装置、溶剂过滤器、液相色谱仪。（2）试剂。乙腈、二氯甲烷、冰乙酸、硼氢化钾、酸性氧化铝。

2.孔雀石绿样本标准。一般情况下，有色孔雀石绿和无色孔雀石绿的含有量存在一定差异性，比如，有色孔雀石绿在样品中的纯度可以达到98.5%，无色孔雀石绿则可以达到92%，无色孔雀石绿也可以称为隐性孔雀石绿。

3.其他耗材和液相色谱条件。（1）其他耗材。有机滤膜、无机滤膜、注射器，注射器的主要作用是提取样品物质。（2）液相色谱条件。为了更好地分析孔雀石绿的具体情况，在检测过程中应用了液相色谱技术，此类技术在执行的过程中需要满足一定的条件，才可确保后续工作可以顺利执行。首先是色谱柱和流动相，后续结合乙酸铵缓冲溶液的流入，设定具体的流速的和色谱柱的温度，来判定孔雀石绿的具体含量。

三、检测方法

随着水生动物的不断运动和新陈代谢，其体内的孔雀石绿会逐步透明化，此时对于水生物而言，体内的孔雀石绿所形成的毒素最高。为了确保水产品的安全问题，检验人员陆续开展了水产品中孔雀石绿残留量的检测工作，本文探讨的检测方法主要是理化检测法和免疫学检测法。

1.前期处理方法。以鱼类为基础，选择指定数量的组织肌肉并称重，结合实际需求选择适当的样品，将其放入离心管中，再取出适当的试剂将其放入硼氢化钾溶液中，按照旋涡方向进行震荡工作，震荡时长不得超过3min，后续再放置15min左右，而且在15min内应该持续震荡工作，震荡结束后，每隔1min进行1次此项工作。继续向离心管内添加适当的试剂，再震荡1min，1min静置结束后，向离心管内添加酸性氧化铝，继续旋涡震荡。彻底结束旋涡震荡工作后，收集上层溶液，然后向残留的液体内部添加二氯甲烷，剧烈震荡1min后重复以上相关步骤，不断反复移除上层溶液，直至实验结束为止。

最底层的物质需要得到良好的净化，净化步骤具体如下：首先将残留物放置在相应的容器内，再安装固相萃取装置，然后进行2次以上的活化工作。转移提取液中的物质，利用乙腈溶液先将柱体清洗干净，清洗结束后吹干固定柱体。向最底层物质内加入乙酸铵溶液进行洗脱工作，收集相应的洗脱溶液，过滤后上机测试。进行测试时要把控好各类溶剂的剂量，结合实际需求配比，以便使其在检测工作中发挥出重要作用。

2.理化检测法。（1）薄层层析法。薄层层析法主要应用硅胶板来分离孔雀石绿，进行孔雀石绿检测时的整体效果较差，定量的范围误差较大，在检测过程中还会形成较多的化合物，整体浓度较高。因此，此类检测方式更适用于高残留量的基质，并不适用于食品檢测工作。

（2）分光光度法。分光光度法应用了分光光度计，此设备自身灵敏度较高，可以针对不同的目标化合物作出测量，还能够对低浓度水平的基质作出测量，以此检测出相应的基质。不过，分光光度法也有一定的局限性，需要在水样中进行检测，不能应用到复杂基质的检测工作中。

（3）高压液相色谱法。高压液相色谱法在使用时需要结合孔雀石绿的沸点和不易挥发性，主要应用色谱分析法来研究液相色谱。根据相应的研究内容，操作人员应该结合各类需求，满足实现分离的目标，后续通过反向柱达成相应的分离需求，当前我国应用较为广泛的是C18反向柱分离。此类实验主要通过孔雀石绿的光学特性，再结合相应的检测手段，目前可以利用的检测器械首先是可编程的紫外可见检测器，其次是紫外线检测器，最后是荧光检测器。在检测结束后，相关数据显示出孔雀石绿在某一结点上会出现吸收峰，此时可以采用紫外线检测器对其进行检测。对于无色孔雀石绿而言，整体吸收峰会发生变化，也会出现荧光液相，所以可以采用荧光检测器进行检测。

（4）液相色谱质谱联用检测法。此类方式一般会应用紫外线可见仪器和荧光检测仪器共同进行检测，检测结果的可靠性一般较高，但是仍然存在假阳性的风险。所以在水产品检测工作中，检测人员应该确保样品的定性结果，在分析有机小分子时也要结合定性的结果对其作出确定，还需要在研究过程中满足相应的条件。此类检测方式在检测孔雀石绿时，目标化合物分离和高压液相色谱法原理相同，都是采用色谱柱对其进行分离研究，以此提高检测结果的准确性。除此之外，还可以应用质谱检测仪器进行检测，以此降低定量所带来的偏差。

3.免疫学检测法。免疫学检测法又被称为酶联免疫法，基本原理主要是将酶分子与抗体分子相结合，以此形成相应的结合产物，不断改变抗体内部免疫学特性，但是此过程并不影响酶的生物学活性。此类抗体一般会在固相载体上，这样才可将其与特性物相结合。其中，酶的主要作用是利用无色还原转变有色氧化物质，让其出现颜色反应，并且针对不同的状态形成不同的显色反应。此类方法也属于敏感检测方法，一般还可分化出多个类别，孔雀石绿检测法采用的是间接竞争抑制法，主要应用人工抗原酶反应，在其内部加入适当的血清或者待测药物使其产生相应的反应。后期通过洗涤确定抗原结合体，并且对其作出标记，形成相应的底物。此时酶催化反应所形成的反应物会与过程中形成的抗体有一定的等量关系对比，据此对其内部所含有的孔雀石绿作出判断，并且规避内部的孔雀石绿物质，使其达成转化的目的，最终形成良好状态。

四、结果分析

针对上述检测结果，根据不同的峰值，总结出了以下内容：首先，通过实验将样品中的孔雀石绿提取出来，并在规定时间内对孔雀石绿的含量作出定性判断。时间数据跟实验过程中各类试剂的使用量有一定关联，因此在实验过程中不仅要满足实验需求，还要严格控制实验试剂使用量，使检测工作更为标准和规范。其次，在实验过程中要注意实验方法的选择，不同的方法适用于不同的实验工作，也会让孔雀石绿的标准有不一样的变化，所以试验工作的质量完全取决于实验人员自身，对于各类可变量的控制就极为重要。

综上所述，为了确保水产品的安全问题，检测人员应该结合实际需求，选择适当的检测方式对水产品进行检测，以此改善水产品的质量安全问题。在检测过程中，相关检测人员为了提高检测质量和水准，需要不断进行试验，这样才能提高我國的水产品检测水平。