间充质干细胞来源的细胞外囊泡在肾脏纤维化治疗中的作用及其机制研究进展

杨清梅，潘博，刘凤，刘晓惠

1 川北医学院临床医学系，四川南充 637000；2 川北医学院附属医院肾脏内科，四川南充 637000

肾脏纤维化（RF）是各种肾脏疾病进展为终末期肾病（ESRD）最后共同的病理表现，其典型标志为肾小球与间质区域中过多细胞外基质（ECM）积聚［1］。根据组织学结构，RF可分为肾小球硬化、肾间质纤维化（RIF）、动脉硬化和血管周围纤维化［2］。RF的主要病理特征包括炎细胞的浸润、成纤维细胞的活化和扩张、ECM的沉积、肾小管损伤以及微血管稀疏［3］。目前ESRD的治疗方式主要为肾脏替代治疗（血液透析、腹膜透析、肾移植），但各肾脏替代治疗方式均存在一定的不足。例如：血液透析及腹膜透析并不能完全替代肾脏功能，且并发症多，患者整体生活质量较差；肾移植因供体稀缺、费用昂贵、免疫排斥等问题致其应用也受到一定限制。所以，在早期积极寻找抗RF的措施显得尤为重要，但目前全世界针对RF缺乏有效、可靠的治疗方式。间充质干细胞（MSCs）是一类存在于骨髓、脂肪、胎盘、牙髓、脐带等多种组织，且具有自我更新、多向分化潜能的成体干细胞，在促进血管生成、抗炎、抗凋亡、抗纤维化以及免疫调节中具有重要作用［4］。目前大量动物实验及体外实验已证实，MSCs治疗可减轻RF［5-7］。但基于MSCs的疗法有一定的风险，比如致癌性、细胞排斥以及病毒污染等，这些细胞移植的安全性问题尚未解决，限制了其在临床上的应用［8］。近年，BORGER等［9］研究发现MSCs可通过以细胞外囊泡（EVs）介导的旁分泌作用发挥其治疗作用。与MSCs相比，间充质干细胞来源的EVs（MSC-EVs）具有低免疫原性、易保存、可人工修饰、无致癌性等独特的优点［10］。故MSC-EVs治疗有望替代MSCs成为新的抗RF措施。现对MSC-EVs在RF中的治疗作用及其相关机制进行综述。

1 EVs与MSC-EVs概述

EVs是一种可由各种细胞释放的脂质膜囊泡，可通过含有的蛋白质、脂质、mRNA、microRNA等成分进行细胞间信号传递，进而调控受体细胞的增殖、分化和凋亡等［11］。由于产生机制、直径大小等不同，EVs可分为外泌体、微囊泡（MVs）和凋亡小体［12］。外泌体的直径为30～150 nm，由多泡体与质膜融合后分泌到细胞外形成［13］。MVs则通过细胞膜以出芽的方式释放到细胞外，直径为100～1 000 nm［14］。MSC-EVs表达其亲本MSCs的特征，包括表面标志物CD44、CD73、CD90和CD105，以及特定的EVs表面标志物，如CD9、CD63和CD81；重要的是，MSC-EVs包含大量mRNA、microRNA和蛋白质，它们通过调节受体细胞中的几种细胞途径来介导MSCs的旁分泌作用［15］。已有研究证实MSC-EVs具有独特的生物学修复作用［16］。

2 MSC-EVs对RF的治疗作用

目前，大量动物实验及体外实验证实MSC-EVs对RF具有明显的治疗效果，这些研究使用了不同肾脏损伤模型以及不同组织来源的MSC-EVs，表明MSC-EVs不仅可预防急性肾损伤（AKI）后纤维化病变的形成，还可延缓慢性肾脏病（CKD）中RF的进展。

2.1 MSC-EVs在AKI模型中对RF的治疗作用 AKI是一种常见的临床综合征，其病因分为肾前性、肾性和肾后性三大类，众所周知，AKI期间的不充分或异常修复会导致纤维化病变形成，最终进入ESRD。BRUNO等［17］发现，静脉注射人骨髓间充质干细胞来源的MVs（BMSC-MVs）可恢复甘油诱导的AKI小鼠的肾脏功能与形态，并且其效果与BMSCs相似。这是MSC-EVs保护肾脏的第一个研究证据。研究发现，在单侧急性缺血再灌注（IR）肾损伤大鼠模型中，人脐带间充质干细胞来源的MVs（HucMSC-MVs）具有抗肾小管上皮细胞损伤并促进细胞增殖的作用，可以明显改善受损肾脏后期的纤维化程度，并保护肾脏功能［18-19］。LIN等［20］向IR肾损伤大鼠单次静脉注射同种异体脂肪间充质干细胞来源的外泌体（ADMSC-exo），发现其可改善RF，与ADMSCs和ADMSC-exo联合治疗相比，其在抗纤维化上呈现出相同的作用。在另一项研究中，CHEN等［21］向IR所致AKI的大鼠静脉注射人类沃顿胶间充质干细胞（hWJMSCs）来源的MVs（hWJMSC-MVs），同样发现hWJMSC-MVs可改善大鼠RF。HE等［22］建立了单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型，发现静脉注射同种异体BMSC-MVs对UUO所致RF有一定修复作用，并且进一步发现MVs发挥修复作用的关键可能归结于其中包括的某类特定microRNA。胡玉燕等［23］研究表明，在UUO大鼠模型中，单次静脉注射人脐带间充质干细胞来源的外泌体（HucMSC-exo）可减少胶原沉积，改善肾脏结构，延缓RF进展。LIU等［24］也以UUO小鼠为研究模型，发现多能干细胞来源的间充质干细胞所分泌的外泌体（PSC-MSC-exo）能够有效抑制内皮细胞损伤，减轻炎症反应，保护肾功能，减缓肾纤维化，并且外泌体水平越高，对肾脏保护作用越好。

2.2 MSC-EVs在CKD模型中对RF的治疗作用 CKD是指由各种原因引起的肾脏结构、功能障碍且病史大于3个月的临床综合征。RF是CKD的重要病理改变，控制RF进程对提高CKD患者生活质量非常重要。GATTI等［25］证明，人BMSC-MVs可改善甘油诱导AKI小鼠模型的肾脏功能及形态，随后，他们将人BMSC-MVs的作用扩展到IR损伤后的CKD模型，发现与未处理的大鼠相比，接受MVs处理的大鼠肾脏显示出较少的纤维化，进而表明MVs治疗还可保护肾脏免受慢性损伤。LIU等［26］将HucMSC-exo通过左肾动脉注射到UUO大鼠中，组织学形态显示该组大鼠RIF面积明显低于UUO组，表明HucMSC-exo可改善CKD中UUO引起的RIF进展。EIRIN等［27］建立了一种新的代谢综合征和肾动脉狭窄猪模型，发现单次肾内递送自体ADMSC-exo可减轻肾髓质氧化、肾脏炎症，从而缓解RF，最终改善肾功能。EBRAHIM等［28］在链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病（DN）大鼠中每天静脉注射2次同种异体骨髓间充质干细胞来源的外泌体（BMSC-exo），持续4周后进行组织学检查，发现肾小球毛细血管、肾小体和肾小管周围的胶原纤维数量减少，表明多次注射外泌体表现出有效的抗纤维化作用。同样，在DN小鼠模型中，GRANGE等［16］研究发现人骨髓MSCs和人肝干细胞样细胞脱落的EVs的多次静脉施用均可预防和逆转肾小球与间质纤维化的进展。有趣的是，在注射成纤维细胞来源的EVs后他们没有观察到RF的改变，这体现了MSC-EVs抗纤维化的特异性。KHOLIA等［29］多次静脉注射人BMSC-EVs对马兜铃酸肾病模型小鼠进行治疗，结果发现，小鼠体质量减轻未见明显恢复，但小鼠血肌酐及血尿素氮降低，肾小管坏死和RIF明显减少。FERGUSON等［30］以诱导的动脉粥样硬化性肾血管疾病猪为研究模型，发现与肾脏血运重建相比，单次肾内递送自体脂肪间充质干细胞来源的EVs（ADMSC-EVs）可以更好地保护狭窄的肾脏微血管系统并减轻肾损伤和纤维化。

3 MSC-EVs治疗RF的相关机制

3.1 下调促纤维化因子 RF的特点是ECM的不平衡沉积和降解，转化生长因子-β1（TGF-β1）作为促纤维化因子通过经典（基于Smad）和非经典信号通路在其起关键作用。LI等［31］第一个提供了脐带MSCs旁分泌的抗纤维化作用可能主要归因于外泌体的证据，并进一步证实，外泌体通过下调TGF-β1，抑制由TGF-β1/Smad2/3信号通路触发的肌成纤维细胞转分化和由PI3K/Akt和MAPK信号通路介导的系膜细胞增殖，并增强MMPs的表达来抑制ECM蛋白的过度沉积，从而改善DN中的RF。CHEN等［21］研究表明，hWJMSC-MVs可改善大鼠RF，这主要是通过下调促纤维化因子TGF-β1水平，上调肝细胞生长因子（HGF）、细胞周期相关蛋白依赖性蛋白激酶（CDK1）、细胞周期相关蛋白（CyclinB1），进而降低肾小管上皮细胞的上皮—间质转化（EMT），减少G2/M期的细胞阻滞来实现的，并且体内外实验证实这些作用通过Erk1/2信号转导。LIU等［32］建立了5/6次全肾切开术大鼠模型和TGF-β1诱导的人肾近端肾小管上皮细胞（HRPTEpiCs）模拟RF以研究人BMSC-exo治疗RF的作用与机制，其结果证实BMSCexo可能通过调节Smurf/Smad7轴在一定程度上对TGF-β1诱导的RF具有抑制作用。Sirtuin 6（SIRT6）是一种保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性蛋白脱乙酰酶，被认为可有效逆转许多器官中的纤维化过程。β-catenin被认为是RF过程中的重要环节。LIU等［24］研究证明PSC-MSC-exo对RF的保护作用是通过上调SIRT6，从而下调β-catenin的表达，进一步降低β-catenin下游产物如Col1-A1、α-SMA等促纤维化因子的表达来实现的。Sox9是一种转录因子，在包括肾脏在内的多种组织和器官的发育中起着至关重要的作用。ZHU等［33］研究表明人脂肪MSCs通过外泌体激活Sox9，进而阻止TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转化为促纤维化表型，最终延缓单侧IR小鼠的RF。EBRAHIM等［28］研究证实，BMSC-exo可通过阻断雷帕霉素的机制靶点（mTOR）途径来降低肾脏中 的TGF-β1，进而 阻 止DN大鼠的RF进 展。ZHANG等［34］专注于研究Oct-4对肾损伤的影响，发现过表达Oct-4的ADMSC-EVs显著抑制了IR小鼠肾损伤引起的纤维化，而低表达Oct-4的ADMSCEVs仅轻微抑制了肾纤维化，表明EVs中Oct-4的表达在抑制肾损伤中起重要作用，证实Oct-4可能通过抑制肾损伤后Snail基因（驱动EMT的主要转录因子）的表达来抑制纤维化进展。总之，上述研究证实MSC-EVs可通过下调TGF-β1、Snail等促纤维化因子，降低肾小管上皮细胞的EMT，抑制纤维化形成的多种信号通路，进而缓解RF。

3.2 减轻炎症反应 CX3C趋化因子配体1（CX3CL1）是一类对巨噬细胞具有强吸引力的趋化因子，主要由血管内皮细胞产生［35］，其在IR肾脏中呈高表达状态，CX3CL1及其受体CX3CR1具有增加肾脏损伤，促进RF的作用［36］。邹翔宇［18］研究证实，HucMSC-MVs可减少IR肾脏巨噬细胞的浸润，同时降低CX3CL1的表达，表明HucMSC-MVs可通过抑制CX3CL1的表达来减少巨噬细胞的肾脏浸润及炎症因子的表达，进而改善IR肾脏后期的纤维化。为了进一步研究CX3CL1与microRNA的联系，他们筛选出具有和CX3CL1 mRNA分子相同的基因保守配对序列的microRNA，包括miR-15a、miR-15b、miR-195、miR-16、miR-497和miR-424，这 些 可 能 对CX3CL1起调控作用。促炎细胞因子的产生可引起肾缺氧和纤维化，IL-10是一种抗炎细胞因子。EIRIN等［27］证实，自体ADMSC-EVs的肾内给药通过减少肾脏炎症，增加修复性巨噬细胞的数量，并上调IL-10的表达来减轻代谢综合征和肾动脉狭窄猪模型的RF。他们的另一项研究还证实，来自瘦猪的ADMSC-EVs显著增加了代谢综合征及肾动脉狭窄猪的肾血流量和肾小球滤过率，并减少了肾小管损伤和纤维化，这可能是通过上调调节性T细胞数量，将促炎巨噬细胞极化为抗炎表型，并减少浸润性炎症细胞和细胞因子，继而改善肾脏炎症实现的，研究还表明来自代谢综合征猪的MSC-EVs的这种能力有所减弱［37］。LU等［38］以UUO小鼠为研究模型，发现人BMSC-exo可通过激活EP2受体、抑制促炎因子分泌、减少肌成纤维细胞转化来调节M1和M2巨噬细胞的极化，从而减少ECM沉积和RF的形成。综上可见，MSC-EVs可通过抑制CX3CL1表达、调节巨噬细胞极化、上调IL-10表达和调节性T细胞数量等途径来减轻肾脏炎症反应，从而抑制RF。

3.3 促进血管生成 ZOU等［39］研究表明，HucMSCMVs可通过HIF-1a独立方式诱导血管内皮生长因子（VEGF）升高来促进血管生成，维持毛细血管密度，防止微血管稀疏，进而减轻IR诱导的肾损伤，并减轻晚期的RF。同时也证明，RNA递送与蛋白质货物都参与了VEGF的调节。CHEN等［40］通过体内外实验证实，来自胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）修饰的人ADMSCs来源外泌体的抗RF作用是通过调节肾小管周围毛细血管生成来介导的，其具体的机制之一是外泌体上调SIRT1，SIRT1进一步通过调节内皮一氧化氮合酶的磷酸化水平来抑制细胞凋亡并刺激血管生成。

3.4 抗氧化应激 众所周知，肾小管易受氧化应激损伤。一项研究证实，单次静脉注射hWJMSC-MVs可通过抑制NADPH氧化酶（NOX）的表达来减轻IR肾脏早期的氧化应激，并且RF在2周时被MVs消除，说明减轻肾脏早期的氧化应激对延缓后期RF形成有一定的作用，表明MSC-EVs可通过抗氧化应激来减轻RF［41］。近年，LIU等［26］研究证明HucMSC-exo可通过抑制活性氧激活的P38MAPK/ERK通路保护UUO肾免受氧化应激损伤，从而缓解RF。

3.5 抗细胞凋亡 细胞凋亡在RF中起重要作用。LIANG等［42］建立了UUO大鼠模拟的RF体内模型和TGF-β1处理人HK-2细胞的体外模型，首次发现人BMSC-exo可将miR-374a-5p从MSCs转移到HK-2细胞并发挥抗纤维化作用，表明外泌体miR-374a-5p有希望用于肾病治疗。该研究进一步证实，外泌体miR-374a-5p通过调节MAPK6/MK5/YAP轴显著抑制HK-2细胞凋亡并阻止体内RF的进展，提示MAPK6/MK5/YAP在RF的发病机制中至关重要。总之，此项研究表明MSC-EVs中的microRNA可以通过抑制细胞凋亡来延缓RF进展。

3.6 其他 HU等［43］发现，由α-1，6-岩藻糖基转移酶特异性催化的核心岩藻糖基化（CF）是多种促纤维化蛋白的关键翻译后修饰，以UUO小鼠及IR小鼠为研究模型，首次发现C57BL/6小鼠BMSC-exo通过CD81-EGFR复合物将miR-34c-5p递送到周细胞、成纤维细胞和巨噬细胞中，miR-34c-5p进一步下调CF以抑制多种信号通路，从而改善多种细胞激活和RF。这是第一份关于MSCs通过调节蛋白质的翻译后修饰来拮抗周细胞活化能力的报道，并且证明外泌体在其中起主要作用。这也是外泌体miR-34c-5p可以抑制成纤维细胞和巨噬细胞活化的第一份报道。总之，以CF为靶点，MSCs衍生的外泌体对多种细胞和信号通路产生广泛影响。JIN等［44］发现，在TGF-β1刺激的NRK52E细胞和UUO后肾脏中let-7i-5p的水平显著上调，而人BMSCs-exo介导的抗-let-7i-5p递送在体外NRK52E细胞中以及体内UUO模型中发挥抗纤维化作用，其结果表明，外泌体抗miR-let-7增加受损肾脏中TSC1的表达，随后降低其下游靶标mTOR、p70S6K和4E-BP1的磷酸化，通过启动TSC1/mTOR通路减弱了RF。

4 结语

在MSC-EVs与RF的研究中，已有大量动物实验及体外实验证实MSC-EVs在AKI和CKD模型中均有治疗RF的作用，但未来仍需要更多的临床研究证实其抗RF效果及安全性。目前研究显示，MSC-EVs治疗RF的机制与下调纤维化因子、减轻炎症反应、促进血管生成、抗细胞凋亡、抗氧化应激等有关。此外，据相关研究证实，经过预处理后的MSCs分泌的EVs具有更好的抗RF作用，预示在今后研究中需要进一步明确提高MSC-EVs疗效的方法，使其能够发挥最大治疗作用。MSC-EVs作为一种新兴的无细胞再生疗法，若能得到有效的研究和利用，将来有望成为有效、可靠的抗RF措施。

利益冲突所有作者声明不存在利益冲突

作者贡献声明杨清梅：论文选题、论文撰写及文献资料的收集分析；潘博：论文审核及修正；刘凤：文献资料收集；刘晓惠：论文审核及修正，指导写作