血小板衍生物在骨关节炎治疗中的应用

刘哲 唐千 位晓娟 张长青 朱振中

骨关节炎（OA）是一种好发于中老年人群的关节退行性疾病，临床主要表现为进行性关节疼痛、肿胀、僵硬及活动受限[1]。随着疾病进展，患者晚期关节功能严重受限，只能接受关节置换治疗，给个人生活及社会经济都带来了沉重的负担[2]。而随着人口结构的老龄化，OA发病率显著提高。据统计，在中国40岁以上人群中，OA患者总数已超过1亿人，占比高达46.3%[3-4]。然而，目前临床上早中期OA的保守治疗手段如口服非甾体类抗炎药和关节腔封闭治疗（透明质酸钠、糖皮质激素、局麻制剂等）虽然可一定程度上缓解疼痛症状，但对损伤软骨的修复作用欠佳，且无法延缓疾病进展[5]。

近年，血小板衍生物被逐渐应用于治疗早中期OA并取得了可观的疗效[6]。目前根据制备工艺，应用于OA的血小板衍生物主要有“三代”产品，即富血小板血浆（PRP）、血小板裂解液（PL）及血小板源性外泌体（PL-exo）[7]。PRP是通过对自体外周血进行梯度离心而获得的浓缩血小板产物，经凝血酶或钙剂的激活，浓缩的血小板可释放丰富的生物活性因子如血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子（TGF）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等以修复损伤软骨。同时，PRP可通过下调白细胞介素（IL）-1、肿瘤坏死因子（TNF）-α等促炎因子的表达，减轻早中期OA炎性反应[8]。目前PRP已广泛应用于OA的临床治疗[9-10]。PL是在PRP基础之上进一步冻融、裂解、离心后所得的浓缩生长因子产物。由于去除了细胞成分，PL免疫源性进一步降低。而PL-exo则是在活化的PRP和PL基础上进行超速离心后获得的含有血小板活性成分的细胞外囊泡，其均质性更佳，有效成分得到进一步浓缩[11]。目前PL和PL-exo尚处于基础研究阶段。

1 PRP

PRP的定义最早由Kingsley等于1954年提出[12-13]，并随着其内含生长因子的发现，于20世纪90年代开始应用于颌面外科手术中组织修复以及一些慢性创面的治疗。其后，PRP逐渐用于治疗肌骨运动系统疾病，特别是一些慢性运动损伤及退行性疾病[14]。PRP因被证实可以修复损伤软骨，缓解局部炎症反应，近年成为早中期OA治疗的主流手段之一[15]。

目前已知PRP中包含1 500多种生物活性物质，其中各种生长因子、趋化因子及细胞外基质蛋白在OA软骨修复过程中发挥着重要作用[8,16]。软骨组织区别于其他组织，缺少有效的营养供应方式，其损伤后修复较为困难且缓慢[17]。维持软骨细胞活性、促进软骨细胞外基质表达及减轻炎症反应对改善OA患者预后，延缓疾病进展具有重要作用[18]。Dos Santos等[19]的实验表明，PRP可以促进软骨细胞增殖，提高软骨细胞中糖胺聚糖及Ⅱ型胶原的表达。Ragab等[20]则在大鼠OA模型上验证了PRP可抑制软骨细胞凋亡信号并下调脂质过氧化物（LPO）及TNF-α等炎症介质的表达水平。Ihnatouski等[21]通过原子力显微镜发现并证实经PRP治疗可有效改善兔OA软骨组织形变。

Migliorini等[22]在荟萃分析中共计纳入了30项有关比较关节腔内注射PRP与其他传统生物制剂对OA治疗效果的随机对照研究，指出在治疗后第3、6、12个月，相较于传统腔内注射制剂（透明质酸或类固醇激素），PRP可明显缓解关节疼痛并改善运动功能，是更为理想的治疗制剂。而Abbas等[23]的荟萃分析进一步统计分析白细胞浓度对于PRP治疗OA效果的影响，认为不同白细胞浓度的PRP对于OA的治疗效果并无明显区别。

虽然PRP对OA有着积极的治疗效果，但作为血小板衍生物的“第一代”产品，PRP仍有一定的局限性。PRP本质为浓缩的自体血小板，仍保留着较强的免疫原性，所以目前应用于临床治疗的PRP大多采用自体回输的方式，这使得一些本身患有血小板相关疾病的患者无法使用。OA的治疗通常需要多次注射，反复采血对于患者也是不小的负担，同时会增加医源性感染的风险。此外，由于PRP的有效成分多为蛋白组分，其有效半衰期短且体外易降解，治疗的稳定性仍有待提高[8]。

2 PL

PL是血小板衍生物的“第二代”产品，作为PRP的进一步加工制品，其很大程度上去除了富有免疫源性的血小板膜成分，同时保留了具有生物活性的生长因子等蛋白组分。因此，PL被认为与PRP具有相似的生物活性，在基础和临床研究中均被证实可以有效治疗OA[24]。

Pötter等[25]比较PRP与PL在静态和机械应力下对体外软骨细胞表型和功能的作用，发现PRP组与PL组软骨糖胺聚糖的表达无显著差异；但在应力环境下，与PRP组相比，PL组软骨细胞亚硝酸盐生成显著减少，而TGF-β1表达则明显增加，提示PL在体外缓解炎症反应及促软骨生成方面更具优势。Gilbertie等[26]研究发现，PL可抑制滑膜细胞炎症介质分泌并促进透明质酸合成；用PL干预的滑膜细胞条件培养基处理滑膜细胞可促进其细胞外基质蛋白的分泌。Yan等[27]在体内大鼠OA模型中验证了PL可通过抑制TNF-α介导核因子-κB（NF-κB）信号，从而抑制炎症反应。此外，Yan等[28]研究发现，相比于PRP，PL促干细胞增殖和迁移的作用更为显著，其分子机制可能与自噬效应蛋白（Beclin-1）依赖性的细胞自噬相关。联合PL与脐带间充质干细胞能在OA治疗中发挥协同作用。

Al-Ajlouni等[29]通过前瞻性的临床试验研究PL对早中期OA的治疗效果，在治疗第32、52周，通过僵硬、疼痛、症状、日常生活和运动功能5个评分量表进行评估，发现关节腔内注射自体PL可缓解早中期OA患者疼痛症状，提高患者生活质量，改善疾病预后，是一种相对有效且安全的治疗手段。虽然该试验样本量偏小，但却是第一个在临床试验方面评价PL对 OA治疗效果的研究。然而，由于目前PL并未广泛应用于OA的临床治疗中，所以尚缺少其与PRP疗效对比的研究。虽然异体来源的PL尚未有应用于OA治疗的报道，但其在角膜病和神经退行性疾病中的应用已进入前临床实验阶段[30]。

总体而言，相较于PRP，PL的制备工艺显著降低了自身的免疫原性，为异体应用提供了可能性，扩大了其临床应用。此外，PRP对储存温度较敏感，生物有效周期短，而PL则可稳定地储存在0℃以下的冷冻环境中，可多次使用。这一定程度上降低了存储及维护成本，以及反复穿刺带来的风险，有效降低了血小板衍生制品在临床应用中的浪费率[31]。相较于第一代的PRP，第二代的PL具有相当甚至更优的软骨修复作用及更灵活的使用场景，未来有望取代PRP在临床实践中成为新一代的关节腔注射制剂[24,32]。

3 PL-exo

作为细胞外囊泡的重要组成部分之一，外泌体是一种直径在30～150 nm的含有多种蛋白质、核酸及脂质等生物活性成分的微小囊泡[33]。外泌体是细胞间传递生物信息的重要纽带，在各种生理及病理过程中都发挥着重要作用。多种细胞来源的外泌体如骨髓、滑膜和脂肪间充质干细胞来源外泌体及PL-exo等均已在基础实验中被报道能够有效治疗OA[34-35]。有研究对PL进行蛋白质谱分析，发现细胞外囊泡为其主要组分，因此推测PLexo可能是PL发挥生物学功能的主要途径[36]。目前报道的PL-exo的获取来源主要有对PRP进行提取和直接对PL进行进一步的超速离心加工[37]。由于免疫源性的存在以及血细胞的残留，PRP无法进行多人份的混合（可能会导致凝血），每次只能进行单人份PRP的外泌体提取，获取量较少且成本较高。而PL由于免疫成分的剔除，可以进行一次性的大量提取，但PL制备过程中需要反复冻融PL，这使得所获得的外泌体膜可能会出现破裂。因此，PRP与PL各有优势，标准化的制备工艺仍有待进一步研究[11]。

2014年，Torreggiani等[38]首次成功从人PL中分离纯化出外泌体，并对该外泌体组分进行初步分析，发现PL-exo保留了碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、TGF-β、PDGF-BB等多种组织再生相关生物因子。相较于PL，PL-exo白蛋白等血清成分被剔除，使得有效成分进一步浓缩，是更为理想的组织修复制剂。随后，Liu等[39]在体内外研究中发现来源于PRP或激活PRP的PL-exo拥有相似的软骨保护作用，其潜在分子机制可能与激活Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号转导通路，抑制软骨细胞调亡相关。Otahal等[40]比较单纯PL-exo与超急性期血清来源外泌体对于软骨细胞的调控，结果提示两者均能促进细胞外基质合成代谢，但PL-exo可以显著降低IL-1等炎性因子的表达水平。

作为血小板衍生物的进一步加工产品，PL-exo具有良好的均质性、较低的免疫原性及更为浓缩的生物活性组分。此外，得益于天然的磷脂双分子层的膜结构，PL-exo能够更好地进入细胞内而发挥作用。虽然目前尚无有关PL-exo应用于OA的临床对照研究，但美国梅奥诊所的学者们已成功制备了PL-exo冻干粉，复溶后仍能保持良好的囊泡结构，并对创面愈合及肌腱具有修复作用[41-42]。因此，PL-exo有望成为一种批量生产的血小板衍生物产品，可实现标准化生产和异体使用，有着广阔的临床前景。

4 展望

血小板衍生物目前在OA治疗上已取得了许多突破。无论是最初的PRP还是后来的PL及PLexo都被证实是相对理想的软骨损伤修复制剂。但是目前针对血小板衍生物仍缺乏相对统一的制备工艺、准确的行业规范及基于此的临床应用指南。同时，目前仍有许多问题如注射后的局部代谢降解、组织在位性及靶向性等亟待解决。此外，血小板衍生物成分复杂，其治疗OA的具体分子机制仍尚未阐明，对相关机制的探索有助于对其进一步的优化提纯。相信未来基于血小板衍生物的治疗手段将不断完善，并使越来越多的OA患者受益。