外泌体联合可注射生物材料治疗脊髓损伤

韩博 蔡闯 崔学文

脊髓损伤（SCI）常由车祸、跌倒和暴力导致，而患者往往很难获得有效治疗，由此引发的截瘫、压疮、肺部感染等多种并发症可能严重影响患者的生活质量，并大大增加损伤后的病死风险[1]。近期研究认为，SCI局部组织会在伤后出现水肿、出血、神经元变性、炎症和细胞凋亡等[2]，而在其周围形成的神经胶质瘢痕则会成为神经元轴突再生的物理屏障，局部组织随之坏死并形成空腔[3]。在多种因素综合作用下，SCI将造成不可逆的后果。目前一致认为，改善损伤区域微环境[4]，减轻损伤脊髓内神经元和少突胶质细胞的神经炎症损害，减少程序性死亡或凋亡细胞[5]是治疗SCI的普遍原则。

1 间充质干细胞外泌体治疗SCI机制

近年多项研究均表明，间充质干细胞外泌体（MSC-Exo）在SCI修复方面潜力巨大，可以通过多种途径对SCI改变产生正向影响。①通过上调血管生成相关基因表达促进血管生成，改善缺血、缺氧的微环境，从而减少损伤部位修复的不利因素[6]。②诱导神经元轴突生长，减少硫酸软骨素蛋白聚糖产生，延缓星形胶质细胞增殖并抑制神经胶质瘢痕形成，从而促进神经功能恢复[7-9]。③通过抑制细胞凋亡修复SCI，包括下调凋亡相关基因Bax表达水平，升高抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平[10]以及通过负性调节caspase-8依赖性凋亡途径减少少突胶质细胞凋亡[11]，从而改善SCI神经纤维的脱髓鞘状态，并对其形成有效保护。④通过抑制促炎巨噬细胞/小胶质细胞极化，促进小胶质细胞由M1型向M2型转化并下调炎性因子表达，调节局部损伤组织的炎症反应[12-14]，从而在SCI修复中发挥重要作用。

许多实验研究结果均表明，MSC-Exo在单独应用时有一定的局限性，而在与可降解水凝胶、纳米颗粒、复合材料等可注射生物材料联合应用时，其在诸多领域优势突出。

2 可注射材料用于外泌体治疗SCI

随着微创手术的普及，可注射生物材料得到了广泛研究。研究表明，可注射生物材料可以精确定位病变部位，反复注射则可实现组织完全再生，其中一些材料硬度与人类脊髓相当，并具有非常优秀的保水性[15]。另有许多材料可提供靶点与生长因子、酶、抗炎因子等功能化配体结合的机会，以允许细胞附着、发芽和促进细胞外基质（ECM）再生，从而为可注射生物材料联合MSC-Exo治疗SCI奠定基础。

2.1 水凝胶

水凝胶是由亲水性聚合物链通过物理或化学交联形成的三维结构。由于聚合物主链中存在亲水性官能团，水凝胶可以吸收大量的水而发生广泛膨胀，却不会发生溶解[16]。作为一种高度水化的聚合物网络，水凝胶能够模拟细胞在自然状态下的存活环境，因此成为药物和细胞治疗研究中的主要载体[17]。水凝胶较为柔软，其水合形式与天然神经组织相似，故常用于促进SCI后的轴突生长和组织形成[18]。

溶胶状态的水凝胶可呈现为理化性质独特的低黏度流体，在被注入伤口后则会发生原位凝胶化，而其凝胶状态更加稳定。可注射水凝胶生物相容性良好，在给药后可与伤口区域紧密接触，且在发挥作用的过程中不会被轻易移除，因此可以有效填充病变腔，并与脊髓无缝结合[19]。水凝胶的另一个优点是，它们可以通过微创技术被直接注射到靶区域或靶组织中，从而避免二次损伤[20]，因此水凝胶是治疗SCI的理想伤口敷料。MSC-Exo具有免疫调节和组织再生功能，因此负载MSCExo的水凝胶常用于SCI协同治疗。

Fan等[21]发现，导电水凝胶可与神经组织的电学特性和力学特性匹配，有望用于促进SCI修复。负载MSC-Exo的双网络导电水凝胶功能良好，可在SCI治疗中抑制炎症反应，增强神经干细胞募集能力并促进神经元和髓鞘相关轴突再生，有助于SCI小鼠恢复运动。

Cheng等[22]对一种包裹MSC-Exo的明胶甲基丙烯酸水凝胶（GelMA）进行研究，发现该水凝胶可以明显促进神经干细胞的神经分化，减少星形胶质细胞瘢痕形成，并增加轴突生长，从而诱导SCI后神经功能恢复，且外泌体联合水凝胶较单纯外泌体修复效果更显著。应用负载MSC-Exo的水凝胶已成为一种值得肯定的SCI修复方法。

Li等[23]研究发现，基于PPFLMLLKGSTR肽修饰的透明质酸（HA）水凝胶（pGel）和人胎盘羊膜间充质干细胞（hMSC）外泌体联合应用可对SCI神经组织微环境产生影响，而诱导型一氧化氮合酶（iNOS）过度表达则会加速SCI炎症进展和神经元变性过程。在该水凝胶被植入后，病变部位iNOS表达会显著降低，提示该水凝胶在侵袭性炎症急性期具有抗炎作用。

近年来，很多研究团队对各种类型的水凝胶联合MSC-Exo治疗方案进行尝试，如Mukhamedshina课题组[24]使用的纤维蛋白水凝胶、Zaviskova等[25]研究的透明质酸水凝胶以及Yao等[26]采用的明胶水凝胶等，均被证实具有促进SCI修复的作用。在不同的外部刺激作用下，水凝胶可以从溶胶向凝胶状态转变[27]，使得水凝胶在医学领域的应用可能性更大。在综合其他优势的情况下，水凝胶已成为开发SCI及其他神经损伤疾病治疗方案的理想研究对象。

2.2 纳米颗粒

与纳米颗粒（NP）结合的间充质干细胞（MSC）在组织再生中应用广泛。NP是直径为1～100 nm的超细颗粒，其制造方法即双乳液/溶剂蒸发技术，可在NP中嵌入特定信号或细胞[28]。根据其内部结构组成的不同，NP可以分为：①金属NP，即金NP（AuNP）、银NP（AgNP）和氧化铁NP（IONP）；②无机NP，即硅NP（SiNP）、陶瓷NP（CNP）；③有机NP，即海藻酸钠、聚乳酸-羟基乙酸和羟基磷灰石（HAp）[29]。

大量研究证实，外泌体在治疗多种疾病方面潜力巨大，但相关研究领域仍然存在2个关键挑战，即可重复制备能力及有效的体内跟踪治疗能力。NP在体内跟踪治疗方面具有许多优点：高重复制备能力、长期跟踪能力和多功能性潜力[30]。作为造影剂，AuNP的X射线衰减能力良好，毒性低，且体内循环时间较长，在CT成像方面具有很大优势。因此，AuNP已被开发为CT检查的有效对比剂[31]。

Chang等[32]研究发现，将IONP作为表面涂层覆盖在胎牛血清的蛋白质上（实验采用胎牛血清作为外泌体纯化的生物测定分析物），并使用磁铁捕获和沉淀蛋白质，可将溶液蛋白质浓度降低至初始时的39.89%，从而达到外泌体纯化目标，且不会损坏外泌体。Azizi等[33]对暴露于NP的嗅鞘细胞进行四甲基偶氮唑盐（MTT）试验，发现在不同NP浓度和不同NP培养时间的条件下，实验组细胞性质和活力与对照组并没有显著差异（P＞0.05），该结果表明NP对细胞存活和活力没有不利影响，证实NP在嗅鞘细胞培养中的生物相容性和无毒性。Han等[34]为改善受损神经元功能，将带正电金纳米颗粒（GNP）嵌入脊髓全切大鼠受损部位的胚胎脊髓源性神经祖细胞（NPC）中，发现GNP不仅可以在体外促进胚胎NPC的神经元分化生长，而且可以诱导SCI大鼠受损神经元恢复；嵌入GNP的NPC诱导SCI大鼠恢复运动功能的表现优于单纯NPC。上述研究均证实，NP在修复SCI和治疗其他复杂的神经损伤方面具有巨大潜力，因此负载MSC-Exo的NP有望成为治疗SCI的可注射材料。

近年来，不少团队将金属NP作为靶向载体，以磁铁作为引导，将携带外泌体的金属NP传递到靶细胞并发挥作用。Kim等[35]将IONP和MSC联合制备IONP-外泌体纳米囊泡（NV-IONP），发现外磁场不仅可以有效控制注入人体的IONP定位，而且可以增加NV-IONP内各种治疗性生长因子及其mRNA数量。NV-IONP通过磁引导到达损伤部位，发挥诱导血管生成、抗凋亡和抗炎作用，可以参与损伤脊髓修复，并显著改善脊髓功能。

2.3 复合材料

复合材料是指由2种或2种以上不同理化特性的生物材料组合产生的新材料。用于SCI修复的可注射复合材料通常由嵌入水凝胶中的纳米管/NP/纳米纤维/微管制成。大量文献表明，用于治疗SCI的复合材料已得到广泛研究，它们往往可以兼具2种及2种以上不同生物材料的理化性质，因此具有独特优势。

He等[36]构建了一种由脱细胞脊髓细胞外基质凝胶（DSCG）和明胶水凝胶（GelMA）组成的新型复合支架，该复合支架具有优化的生物活性成分和有利的微结构，能够提供双重仿生微环境，可以促进经血来源的MSC（MenSC）的黏附、增殖和分化，并完全横断SCI大鼠损伤间隙。该研究结果表明，复合支架与MenSC联合应用可以减轻炎症反应，促进神经元分化，并改善运动表现。Haggerty等[37]研究发现，负载MSC的纳米纤维水凝胶复合物（NHC）可以使SCI部位由促炎环境向抗炎环境转变，与负载MSC的磷酸盐缓冲液（PBS）组相比，负载MSC的NHC组大鼠在损伤后有更多巨噬细胞极化为促再生表型，伤后8周时损伤范围减小，星形胶质细胞增多，轴突增多。Chen等[15]将聚乙烯醇（PVA）与硫化钼/氧化石墨烯（MoS/GO）纳米材料结合，制备出一种生物相容性、柔软性良好且兼备高导电性和高抗炎活性的复合水凝胶，并证实该水凝胶可以促进神经干细胞向神经元分化，抑制星形胶质细胞发育，从而有助于运动功能恢复。

在诸多相关研究中，研究者选用不同材料进行制备的复合材料很多。除上述材料外，还有自组装多肽（SAP）以及各种类型的生物材料支架等。SAP是指通过亲水性和疏水性氨基酸交替排列或正负电荷氨基酸有序排列设计，可以依据温度和pH变化自互补组装形成的纳米纤维水凝胶支架，其优点是能够搭载更多细胞或药物，但缺点也十分明显，即成本过高。在大多数已有研究中，研究对象常以纳米材料复合水凝胶、生物支架等复合形式发挥作用，它们在治疗SCI时均保有个性化优势，因此探索稳定、有效、低成本的载体是有待实现的下一个目标。负载外泌体的复合材料疗法为中枢神经系统疾病的有效治疗提供了一种有前途的策略。

3 结语

尽管多种可注射生物材料在临床工作中早已广泛应用，其安全性和稳定性已得到保障，但在联合外泌体有效治疗SCI方面仍有待完善。未来的研究方向之一可能是优化可注射材料的生产，包括避免材料因溶胀不受控导致继发性损伤、在材料制备过程中更精确地模拟ECM成分和机械性能及配合病灶进行性能调控等。许多团队在此项研究中已经取得较为明显的进展。目前用于SCI治疗的负载MSC-Exo可注射生物材料的临床试验尚未取得满意结果[38]，有效修复SCI的研究工作任重道远。Koffler等[39]开发了微尺度连续投影打印的方法，可以制造出能与啮齿动物损伤脊髓相契合的三维仿生水凝胶支架，能够实现突触再传递并显著改善神经功能。这项研究或许将成为未来研究的热点之一。