非洲猪瘟病毒研究进展

张 帅，刘 媛，赵云环，刘 莹，左玉柱*，范京惠*

(1.河北农业大学 动物医学院，河北 保定 071001；2.河北省邢台市邢东新区社会发展局动物卫生监督所，河北 邢台 054000；3.河北省兽医生物技术创新中心，河北 保定 071001)

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染引起的猪的一种高度接触性、致死性传染病，病死率高达100%[1]，其自1921年在肯尼亚首次被发现[2]以后，已蔓延至南美洲、欧洲和亚洲国家，对全球养猪业造成了巨大的经济损失。2018年8月传入我国后，迅速在我国各地猪场蔓延，由于该病目前没有商业疫苗和有效防控方法，目前控制ASFV传播的措施是对感染和接触猪立即扑杀并深埋，导致我国生猪产业的生产规模、结构以及供应结构均受到一定影响，严重危害了我国养猪业的健康发展[3]。

ASFV是一种具有复杂分子结构的线性双链DNA病毒[4]，为非洲猪瘟科非洲猪瘟属唯一成员，基因组大小在170～190 kb之间，能够编码超过200种蛋白质，且绝大部分蛋白质的功能尚不清楚。ASFV结构和功能复杂多样的特性在很大程度上阻碍了病毒-宿主间作用机制的探明及疫苗研发的进程，也给ASF的有效防控带来了挑战。近年来，ASFV的相关研究取得了巨大的成就，但仍只是少部分蛋白的结构和功能被解析，现对ASFV主要蛋白质功能、检测方法和疫苗研究方面的进展进行综述，以期为ASFV-宿主间作用机制研究、ASF快速及早准确地筛查检测和疫苗的研发提供基础性帮助。

1 ASFV蛋白质功能研究进展

ASFV具有庞大的基因组，整个基因组编码200多种蛋白质，其中超过50种为结构蛋白，分别参与维持病毒形态结构[5]、基因转录与功能修复、病毒入侵和复制、宿主细胞免疫调控等[6]过程。掌握病毒蛋白的功能和特性，是建立检测方法、研发疫苗以及探明病毒-宿主之间相互作用机制和病毒免疫逃逸机制的基础，以下将根据病毒粒子结构由内到外所包含的主要蛋白质及功能进行综述。

1.1 病毒核心蛋白ASFV的核心由基因组和核蛋白组成，其中发挥主要功能的核蛋白是pA104R蛋白。pA104R蛋白是一种高度保守的组蛋白样DNA结合蛋白，与大肠杆菌U93的组蛋白样蛋白(HU)和整合宿主因子(IHF)最为相似[7]。pA104R蛋白与DNA结合形成染色质，参与异染色质形成、基因印记和转录调控等多种拓扑修饰。FROUCO等[8]研究表明，带正电荷的pA104R蛋白以不依赖ATP的方式结合DNA，并且还与ASFV中拓扑异构酶Ⅱ协同诱导DNA超螺旋；pA104R蛋白是一种中后期蛋白质，能被招募到合成组装工厂进行基因组包装[9]。同时，还有较强的抗原性，是IgG和IgM抗体反应性较好的靶标[10]，且无症状感染猪对pA104R的抗体反应高于慢性感染猪，因此，针对pA104R蛋白的抗体可能是有效免疫反应的指标[8,10]，可用作血清学诊断。LIU等[11]研究指出,ASFV的DNA包装是一个高度动态的过程，病毒可能采用一种混合机制，以pA104R蛋白为中心，使DNA迅速压缩，这可能是产生大量ASFV颗粒维持成功感染机体所必需的关键。当前缺失pA104R蛋白的BA71株已经构建，但基于疫苗的体内研究还未取得阶段性进展。体外研究结果显示，pA104R蛋白与DNA的结合可被二苯乙烯类化合物所破坏，从而抑制ASFV在原代猪肺泡巨噬细胞中的复制，提示pA104R蛋白在ASFV复制过程中具有重要作用以及pA104R蛋白有望成为抗病毒治疗的靶标[11]。

1.2 核壳蛋白核壳蛋白包裹在核的外层，是一层约30 nm厚的蛋白质层，主要由多聚蛋白pp220和pp62组成，在结构上起到保护核的作用，在病毒的组装和病毒的感染过程中具有重要作用[12]。GERMN等[13]发现，pp62蛋白的加工需要pp220蛋白核心前体的表达，pp220和pp62蛋白的加工都依赖于主要衣壳蛋白p72的表达，pp220和pp62蛋白的表达，是成熟ASFV的重要标志，pp220和pp62蛋白加工合成被抑制，会导致缺损病毒或无感染性病毒粒子的出现[13-14]。据报道，pp220蛋白具有衔接病毒核衣壳和囊膜的功能，pp220蛋白在被S273R蛋白酶酶解后加工形成p150、p37、p34和p14等主要结构蛋白，参与核壳的组装，其中p37蛋白能够穿透细胞核，参与细胞质的转运[15]。ANA等[16]利用莱普霉素B和靶向CRM1受体的siRNA进行的试验表明，p37蛋白的亚细胞定位不受CRM1介导的核输出通路抑制的影响，并通过原位杂交试验中ASFV DNA和p37蛋白在感染后的早期于特定的核区域、后期在病毒工厂中共定位证实了这一结论；pp62蛋白被S273R蛋白酶酶解成p15和p35蛋白，共同参与DNA复制和核壳的组装。GERMN等[13]通过免疫荧光显微镜观察到抗p35和抗p15抗体都能在病毒工厂以及细胞质中被检测到，为了更详细地研究p35和p15蛋白在组装位点的分布，进一步对ASFV感染细胞处理后通过冷冻切片进行了免疫金标记，结果显示在接近病毒膜结构(ASFV粒子的前体元素)的地方检测到显著标记，与免疫荧光结果一致。曹乾大等[15]通过对ASFV Pig/HLJ/2018株pp220蛋白进行分子生物信息学分析，筛选出了53条优势的B细胞抗原表位和23条强结合的优势T细胞抗原表位区域，为靶向药物、表位疫苗的研制提供了新的候选对象。这些研究发现，均对于ASF防治和疫苗的研发有着重要意义。

1.3 内膜蛋白内膜蛋白主要由p12、p17、p30、p54蛋白组成，分别由O61R、D117L、CP204L、E183L基因编码。p12蛋白参与病毒的黏附入侵；p17蛋白是维持病毒二十面体结构的重要蛋白，参与各蛋白组装病毒粒子后的形态转化，同时还能对S273R蛋白酶起抑制作用，抑制多聚蛋白pp220和pp62的酶解[17]。p30蛋白是重要的毒力蛋白，参与宿主细胞的入侵，在感染早期表达并持续存在于整个感染周期，是最具免疫原性的蛋白之一，这2个特点使p30蛋白成为检测ASFV感染的良好诊断指标。PETROVAN等[18]通过免疫沉淀、Western blot和免疫荧光检测对p30特异性单克隆抗体和基于单克隆抗体的诊断进行了分析，为ASFV的检测、监测和疾病控制提供有价值的工具。WU等[19]通过开发21个单克隆抗体与ASFV p30反应，确定了14个包含至少4个线性表位的抗原区域，这些单克隆抗体和确定的p30抗原区为ASF血清学检测的发展和改进提供了有价值的工具。同样，p54蛋白也是进行ASF检测和监测的良好血清学靶点。PETROVAN等[20]通过单克隆抗体制备了针对杆状病毒表达的p54蛋白的多肽，并通过筛选和定位研究确定了p54蛋白上重要的抗原和免疫原性区域，为ASFV诊断提供了新的工具。p30和p54蛋白共同参与病毒入侵宿主细胞，是病毒囊膜形成的关键蛋白，是血清抗体的主要结合位点，还被用作抗原广泛应用于当前国内外荧光定量PCR和ELISA检测成品试剂盒中。ZHANG等[21]将ASFV p30和p54融合到一个新的细胞穿透肽Z12中表达和纯化了2个重组融合蛋白ZPM和ZPMT，通过小鼠评估了蛋白引起的体液和细胞免疫反应发现ZPMT诱导小鼠产生强有力的中和抗体反应和细胞免疫，表明ZPMT可能是引起猪免疫应答的合适候选疫苗，为ASF亚单位疫苗的开发提供了有价值的信息。HÜBNER等[22]利用编码Cas9的质粒和靶向ASFV p30蛋白71 aa～78 aa密码子的向导RNA稳定转染WSL细胞株，并验证了在至少50代内可以稳定转染基因表达和病毒抑制，该研究是一种有效的传递抗ASF感染耐药性的策略。此外，p54蛋白的过表达能够诱导被吸附细胞的凋亡[23]，p54蛋白能与胞质动力蛋白轻链LC8特异性相互作用，实现病毒在胞质内的转运；当ASFV感染后，p54-LC8复合物与抗凋亡蛋白Bcl-2结合，进而消除Bcl-2对细胞凋亡的抑制作用，导致Caspase-9、Caspase-3活化，介导细胞凋亡[24]。以上研究均为ASFV入侵宿主的机制、ASFV诊断和疫苗研发提供帮助。

1.4 衣壳蛋白衣壳蛋白是维持病毒二十面体结构的主要结构蛋白，由p72蛋白和其他辅助蛋白组成包裹病毒颗粒。p72蛋白由B646L基因编码，在宿主细胞合成后分布于细胞质和内质网中，p72蛋白形成二十面体结构时需要辅助蛋白(M1249L、p17、p49和H240R)的参与，此外由于p72蛋白较为保守且有较高的免疫原性，常被用作诊断用抗原[25]。HEIMERMAN等[26]用杆状病毒表达的ASFV重组抗原片段制备单克隆抗体，通过免疫荧光抗体鉴定和寡肽识别确定所有单克隆抗体均位于p72蛋白的高度保守区域内，为ASFV抗体和抗原的检测提供了新的靶点。CHEN等[27]采用针对ASFV p72蛋白的单克隆抗体M-5和M-6，建立了一种基于均相ELISA的快速、免洗涤、一步夹心式免疫检测方法，该方法特异性好，灵敏度高，进一步提示了p72蛋白在诊断方面的价值。辅助蛋白中的p14蛋白由E120R基因编码，可将组装好的病毒粒子转运到细胞膜，E120R基因的缺失将导致病毒粒子的滞留，进一步影响病毒粒子的复制与合成[28]。

1.5 外囊膜蛋白外囊膜蛋白主要包括CD2v蛋白，由EP402R基因编码，为感染晚期表达的跨膜结构蛋白，具有N端信号肽和单个跨膜结构域，其不是ASFV必须存在的蛋白，有研究表明，将EP402R基因敲除后，不会影响病毒的存活，但是影响病毒扩散的推迟[29]。SEREDA等[30]研究表明，CD2v蛋白能介导红细胞对ASFV感染细胞的吸附作用，并指出ASF保护性免疫可能是血清型特异性的表现。同时，THANH等[31]根据CD2v蛋白HAI特性进行了血清学分型，发现同一基因型下的毒株表现出不同的血清型分型，进一步证实了血清型是决定ASFV分离株之间的同源交叉保护问题和影响疾病出现的病毒决定因素，也提示了ASFV CD2v蛋白的血清分型对疫苗的设计和开发的重要性。CD2v蛋白还在免疫调节中发挥作用，能有效地抑制有丝分裂原介导的旁系淋巴细胞增殖，从而发挥免疫调节作用。BURMAKINA等[32]利用IFN-γ ELISpot 法通过ASF免疫动物的外周血单核细胞鉴定了CD2v和C型凝集素上的6个独立的T细胞表位区域，为ASFV保护性抗原、相关表位及其性质多样性的进一步探明奠定了基础。

2 ASF检测方法研究进展

ASF作为一种高度烈性传染病，由于该病病程极短、病死率极高，发病症状容易与猪丹毒、猪繁殖与呼吸综合征等病混淆，且尚无高效的疫苗，已对全球养猪业造成了灾难性的打击，因此需要通过快速、准确、灵敏的检测方法来诊断ASF，为ASF的预防控制与根除提供基础性的帮助[33-34]。

2.1 红细胞吸附试验红细胞吸附试验(haemadorption，HAD)是基于感染ASFV的单核细胞和巨噬细胞表面能够被猪的红细胞吸附，在出现病变前可形成便于识别的玫瑰花环状[35]，因此该方法早期被用于ASFV的检测，直到1963年，有研究发现了没有红细胞吸附能力但是可以发生病变的ASFV，导致出现假阴性的结果，同时由于HAD整个过程需要1周的时间，无法满足当前ASF发病迅速需快速筛查的需求，因此当前没有得到广泛应用。

2.2 荧光抗体检测荧光抗体检测(fluorescent antibody test，FAT)是利用标记了异硫氰酸荧光素(FITC)的特异性抗体与感染发病猪的组织中的ASFV抗原结合，通过显微镜观察荧光情况来判定是否感染ASFV。FAT不但可以用于鉴定不产生HAD反应的ASFV毒株，而且可用于鉴别诊断由ASFV或其他病毒感染导致的细胞病变，但由于操作复杂且不能检出亚急性和慢性病例，逐渐被PCR技术取代。

2.3 PCR检测技术聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是当前实验室诊断ASFV最常用的诊断方法，WANG等[36]采用β-actin作为内参基因，以p72基因为靶点，根据GenBank中69条β-actin序列和1 012条p72序列设计引物和探针，以确保覆盖更广泛的宿主和ASFV范围，建立了高度敏感、特异、快速的ASFV实时荧光定量PCR检测方法。LIN等[37]根据ASFVB646L、MGF360-14L和CD2v基因设计了3套引物和探针，建立了可同时鉴别检测ASFV野毒株和基因缺失疫苗株的三重荧光PCR方法，该方法灵敏度比OIE推荐的荧光PCR还高10倍，具有较好的实用性。韦莹华等[38]以ASFV的p72基因作为检测靶基因，建立了一步法可视化等温检测(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，可实现对样本基因组40 min内完成检测，可肉眼直接判断检测结果，该方法为ASF的现场诊断和疫情监测提供了一种可靠、便捷、低成本的选择。WANG等[39]基于p10基因建立了实时环介导等温扩增(LAMP)法和目视LAMP法检测ASFV，为ASFV的预防和控制提供了有前景的解决方案，有助于进行初步的、具有成本效益的监测。曾宇晨等[40]参考ASFVB646L、EP402R和MGF360/505基因保守序列，设计特异性的酶促重组酶扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)探针和引物，建立了42℃等温条件下检测ASFV DNA的ERA方法，该方法对阳性样品的检测下限均为102拷贝/μL，为流行病学调查和现场检测提供了一种快速有效的检测方法。REN等[41]建立了一种基于重组聚合酶扩增(RPA)-CRISPR的ASF核酸检测方法，该方法具有与TaqMan qPCR相同的灵敏度，在养猪业的临床检疫和食品安全方面的应用具有很大的潜力。此外，IDEXX公司基于p72蛋白研制的ASFV实时定量PCR检测试剂盒已经商品化，为ASFV的快速检测提供了帮助。当前无商品疫苗的情况下，根据ASFV复制过程必需且保守的蛋白基因，建立灵敏、特异的PCR方法，对ASFV进行检测，是目前有效防控ASF的重要手段之一，随着ASFV蛋白特性的不断探明，针对不同蛋白基因的检测方法也将逐渐建立。

2.4 ELISA检测酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)适合于短时间内对样品的大规模筛查，是ASFV抗体检测所使用的主要方法，目前商品化的检测试剂盒主要以强免疫原性的p30和p54蛋白作为检测抗原，美国IDEXX公司开发了基于p30和p54蛋白的ELISA检测试剂盒。CAO等[42]制备ASFV p54蛋白的单克隆抗体并确定了该单克隆抗体的靶表位，利用合成的表位肽作为抗原建立了高敏感性和特异性的ELISA方法，对ASF疫病的监测和控制具有很大的潜力。TESFAGABER等[43]通过制备和鉴定p54蛋白单克隆抗体开发了一种基于单克隆抗体的竞争性酶联免疫吸附试验(cELISA)用于ASFV抗体检测，为快速、方便的ASFV血清学诊断提供了一种有前途的方法，可作为其他血清学方法筛查ASFV感染的替代方法。GIMÉNEZMUR等[44]通过多重荧光微球免疫分析(FMIA)，比较ASFV感染猪的早期血清抗体反应(NHV-p68分离物)与3种主要的重组多肽(p30、p54、p72)，选择作为ELISA的重组蛋白，开发了一种基于重组蛋白p30间接ELISA方法检测血清和唾液，为AFS的检测提供新的方法。LI 等[45]提出双QDM重组病毒蛋白p30和p54探针和体外预培养，作为QDM基础的ASFV免疫传感器(QAIS)，用于血清中ASFV抗体的超敏定量检测，与商品化酶联免疫吸附试剂盒(ELISA)和胶体金免疫试纸条(CGICS)相比，其检测灵敏度分别至少提高1个数量级和4个数量级，具有很好的实用性。ASFV ELISA抗体检测对于猪群ASF的防控中起到重要作用，不仅可用于ASF隐性感染猪的筛查，还可为ASF疫苗上市后的免疫效果评价提供工具。

2.5 胶体金免疫层析技术胶体金免疫层析技术(colloidal gold immunochromatography assay，CGICA)具有方便、精准、快速、灵敏等优点，广泛应用于多领域的检测中[46]。邬旭龙等[46]利用原核表达系统表达纯化的ASFV pK205R蛋白制备了ASFV胶体金免疫层析试纸条，该方法具有较高的特异性，对表达的重组蛋白最小检测量为30～40 mg/L，为ASFV阳性养殖场的带毒猪快速筛选提供便捷的条件。LI等[47]选择截短的p54蛋白作为抗原，并将其与铕元素掺杂的荧光微球结合作为示踪剂，特异性检测ASFV抗体，该方法与商业ELISA试剂盒的检测结果具有较高的一致性。WANG等[48]将重组酶聚合酶扩增(RPA)与侧流相结合，开发了用于ASFV即时诊断的金纳米颗粒检测条，该方法不需要任何昂贵的仪器，在ASFV疫情监测和控制中具有广阔的应用前景。

3 ASF疫苗研究进展

自1921年ASF在肯尼亚暴发以来，关于ASF疫苗的研究和讨论从未停歇，但是由于ASFV庞大的基因组、复杂的免疫逃逸机制和庞杂的宿主细胞信号调控通路，导致对ASFV的遗传变异以及参与宿主适应和病毒与宿主之间的相互作用认识的不足，阻碍了有效疫苗的开发，但近年来对ASF疫苗的探究成果为有效疫苗的研发提供了理论基础和技术支持。

3.1 灭活疫苗灭活疫苗是先对病毒或细菌进行培养，再用加热或化学试剂将其灭活后结合佐剂制作而成的疫苗。因其具有安全、不存在散毒危险、便于贮存和运输等优点，灭活疫苗得到了广泛的应用。同样，对ASF灭活疫苗也展开了研究，但由于在宿主细胞内外不同区域成熟ASFV粒子的病毒颗粒表面蛋白有着巨大差异，免疫原性的差异也会受到影响，接种猪后虽然产生抗体但不能对机体起到保护作用[49]，目前关于灭活疫苗的研究还在进一步进行中。

3.2 减毒活疫苗减毒活疫苗是将病原微生物在人工条件下使其致病性减弱，但仍保留其繁衍能力和免疫原性，制成的减毒活疫苗，即保持了抗原性的一类疫苗。该种疫苗无需添加佐剂，价格低廉，将其接种到体内后，通过刺激机体产生特异性的记忆B细胞和记忆T细胞，起到长期或终生保护的作用。目前，可将ASF减毒活疫苗分为自然致弱活疫苗和重组致弱活疫苗。自然界中存在的2株ASFV弱毒株NH/P68和OUR/T88/3，对猪群免疫后可获得抗亲本毒株的免疫保护，并能起到交叉保护作用，NH/P68可促进T淋巴细胞和NK细胞的活性，并抵御ASFV/L60强毒株的攻击，但会造成部分猪群的慢性感染，导致病毒的传播蔓延[50]。OUR/T88/3能抵御多株毒株的攻击，但是保护力会随着T淋巴细胞的衰竭而减退，最后引起猪群发病[51-52]，这也阻碍了这2株病毒作为ASF减毒活疫苗的推广使用。

同样，对重组致弱活疫苗的研究也在进行中。PAULA等[53]将ASFV Georgia 2007分离株同时删除9GL和UK基因，免疫猪群后发现可以免受BA71的攻击。DOUGLAS等[54]通过敲除9GL基因后，再删除CD2v和C型凝集素样病毒基因，构建了2种新的重组病毒ASFV-G-△9GL/△CD2v和ASFV-G-△9GL/△CD2v/△EP153R，发现ASFV-G-△9GL/△CD2v/△EP153R在猪巨噬细胞中的体外复制能力降低，同时ASFV-G-△9GL/△CD2v和ASFV-G-△9GL/△CD2v/△EP153R在接种猪群后诱导了几乎无法检测到的病毒血症水平，但是未能保护机体免受强毒ASFV Georgia的攻击。张艳艳等[1]以我国首例ASF疫病中分离的流行毒株SY18为亲本株构建了多基因家族MGF基因和CD2v基因缺失的ASFV基因缺失疫苗，针对安全性和有效性的研究结果显示接种猪能够100%抵抗亲本强毒株SY18株的攻击，说明该毒株可作为ASF疫苗候选株。TESHALE等[55]构建了同时缺失CD2v和UK基因的ASFV-SY18-△CD2v/UK株，并通过动物试验发现免疫ASFV-SY18-△CD2v/UK猪均能抵抗亲本株ASFV-SY18的攻击，表明能够诱导猪产生保护性免疫应答,可作为控制ASF的潜在疫苗候选株，为研制具有交叉免疫保护效果的疫苗提供了新的思路。

3.3 亚单位疫苗亚单位疫苗是利用微生物的某种表面结构成分制成不含有核酸、能诱发机体产生抗体的疫苗，因其成分中不含病毒核酸部分被称为最安全的疫苗。但由于ASFV强大的基因组可编码超过200种蛋白，给疫苗优质抗原的筛选造成了很大的挑战。目前，许多ASFV亚单位疫苗的研究都以ASFV p30和p54蛋白为基础，这2种结构蛋白分别参与病毒附着和内化，它们都能够诱导机体产生病毒中和抗体[56]。仅用p30或p54抗原免疫猪不足以保护猪免受ASF强毒的侵袭，然而PUERTAS等[56]发现将p30和p54抗原同时免疫猪会使猪的临床症状出现延迟，病毒血症减轻，有半数的试验猪可免于E75毒株的毒力攻击。BARDERAS等[57]用杆状病毒表达的p30/p54融合蛋白免疫猪也能减轻病毒血症，并保护所有猪免受E75强毒株的攻击。IVANOV等[58]研究了选择多肽模仿病毒蛋白建立保护性免疫反应的有效性，在分析ASFV全核苷酸序列的基础上对合成的46个肽段在小鼠体内进行免疫原性检测，筛选出17个最佳的免疫反应诱导肽，为进一步开发一种有效的ASF疫苗提供了依据。

3.4 病毒活载体疫苗病毒活载体疫苗是将致病微生物的免疫保护基因插入到载体病毒的非必需区，构建成重组病毒制备成的疫苗[59]。SHEHNAZ等[60]利用腺病毒作为载体，将ASFV的p32、p54、pp62和p72蛋白分别作为抗原，以鸡尾酒形式免疫猪群，结果显示猪群体内出现了特异性抗体，但是有效性还有待考究。CHEN等[61]通过反向遗传学方法构建了表达ASFV p72蛋白的重组新城疫病毒(rNDV)，发现重组病毒在小鼠体内复制良好，在小鼠模型中评估了其体液和细胞免疫原性，结果表明表达ASFV p72的rNDV可能是预防ASF的潜在候选疫苗。

3.5 核酸疫苗核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防疫病的一类疫苗。ARGILAUGET等[62]将编码ASFV血凝素(sHA)胞外结构域的基因插入到质粒pCMV-PQ的P30、P54融合蛋白基因(PQ)N端从而获得pCMV-sHAPQ质粒，将其免疫猪后尽管不能使免疫猪抵抗ASFV E75毒株的致死性攻击，但免疫猪的体液免疫和细胞免疫反应呈指数级增长。然而在pCMV-sHAPQ质粒的基础上，融合泛素(Ub)基因，获得的质粒pCMV-UbsHAPQ免疫猪后，不能诱导免疫猪产生抗体，但使免疫猪产生了特异的T细胞反应，并能保护部分免疫猪抵抗ASFV的致死性攻击，进一步证实了T细胞免疫在机体抗ASFV中的作用以及DNA疫苗特别是重组DNA疫苗作为未来ASFV候选疫苗的研究潜力。ANNA等[63]构建了一个包含4 000多个质粒克隆的表达文库，用该表达库免疫猪群后发现对E75强毒株的致死性攻击有60%的保护效果，为控制该病毒提供了一个可能的靶点。

4 讨论

近年来，随着对ASFV相关研究的深入，ASFV病毒蛋白的结构及功能逐渐清晰，但由于ASFV基因组庞大，仍有大量蛋白功能尚不清楚。在ASF的防控方面，由于ASFV的复杂性，以及其免疫逃逸机制和具体抗原的知识匮乏，缺乏可用的ASF疫苗，当前预防ASF的主要措施是应用荧光定量PCR进行筛查，但因ASFV传播速度快、发病急等特点，需要对疫区猪只全部扑杀并作无害化处理，因此给养猪业带来巨大的经济损失，导致ASF成为当今世界养猪业的头号威胁，并对全球商业平衡产生了负面影响[64]。

加快ASFV蛋白功能、入侵机制、免疫逃逸机制的探明；确认ASFV各类疫苗的安全性和有效性、加速向行业化转移、进行正式注册和商业化，用于ASFV的预防；建立快速、灵敏、特异的检测方法，用于ASF的精准筛查等，均是有效防控ASF急需解决的问题。