基于网络药理学探讨瘤果黑种草子的抗炎机制*

赵凯悦 刘蜜敏 曾 利 姜海伦 李卓荣 徐 芳 刘 睿

(1.中国医学科学院医药生物技术研究所，北京 100050)(2.新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐 830004)

瘤果黑种草子是毛茛科植物瘤果黑种草(NigellaglanduliferaFreyn et Sint.)的干燥成熟种子，是新疆维吾尔族习用药物，具有补肾健脑、通经、通乳、利尿等功效[1]，其临床制剂常被用于治疗风湿病关节肌肉肿痛、腰膝冷痛[2]。现代药理学研究发现，瘤果黑种草子所含活性成分丰富，在多种疾病动物模型上显示出了抗炎、抗氧化、抑制肿瘤、保护肝脏等良好的药理活性。瘤果黑种草子提取物能够增强抗氧化酶活性，减少脂质过氧化物产生，改善四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤，抑制艾氏腹水瘤小鼠肉瘤生长[3-4]。在抗炎作用方面，瘤果黑种草子提取物能够改善葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎症状，减轻肠道炎性细胞浸润[5]。其活性成分能够降低浓氨水引咳小鼠的咳嗽次数，增强家兔气管纤毛黏液流运动，抑制乙酰胆碱所致豚鼠平滑肌痉挛，降低慢阻塞肺病大鼠模型肺部组织炎性反应程度，改善乙醇诱导急性肝损伤小鼠相关指标水平，缓解佐剂诱导的大鼠关节炎损伤、化学物质诱导的小鼠耳廓肿胀[6-11]。以上动物实验结果提示，瘤果黑种草子在治疗类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病、支气管痉挛、酒精性肝损伤等炎性反应相关的疾病方面有潜在应用。目前，研究者对瘤果黑种草子抗炎作用仅限于药理活性的研究，缺乏对其抗炎作用机制的报道。

网络药理学可利用化合物靶标数据和疾病的人源性数据，针对中药多组分多靶标的性质进行系统性分析，从多角度阐述中药能够调控与涉及的靶标网络，进而分析药物的潜在作用机制。本文基于网络药理学的分析方法，拟通过数据挖掘与分析整合，建立瘤果黑种草子化合物-靶标作用网络，对潜在靶标的生物功能和信息调控通路进行富集，分析瘤果黑种草子抗炎相关的基因、分子和信号通路。

1 材料和方法

1.1 数据库

使用Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)、UniProt数据库(http://www.uniprot.org./)、PubChem数据库(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、DrugBank数据库(http://www.drug-bank.ca/)、OMIM数据库(http://www.omim.org/)、GeneCard数据库(http://www.genecards.org/)Cytoscape(3.7.0)软件(http://cytoscapeweb.cytoscape.org/)、Venny2.1.0在线软件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)、联川生物云平台(https://www.omicstudio.cn/tool/)、Metascape基因注释分析工具(https://metascape.org/)和STRING数据库(http://string-db.org/)等相关平台和数据库。

1.2 成分靶标数据集和炎性反应相关靶标数据集建立

通过文献检索瘤果黑种草子化学成分，利用PubChem和ChemDraw获得成分结构sdf格式文件并借助Swiss Target Prediction预测化合物靶标。分别以“rheumatoid arthritis (RA)”“inflammation”“alcoholic hepatitis”“chronic obstructive pulmonary disease (COPD)”等为关键词在OMIM、Genecards、DrugBank数据库检索炎性反应相关靶标并通过UniProt数据库规范靶标的基因名。

利用在线韦恩图绘制平台Venny2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，绘制化合物和疾病靶标韦恩图，获得二者共同靶标并以此作为瘤果黑种草子抗炎作用的潜在靶标。

1.3 成分-共同靶标网络构建

利用Cytoscape3.7.0构建成分-共同靶标网络，以degree平均值为筛选条件，筛选排名靠前的成分。借助STRING数据库，设置combing score值为0.9，限定物种为Homo sapiens，分析共同靶标蛋白互作网络，以tsv格式保存文件。利用Cytoscape3.7.0中的Network Analysis工具分析互作网络，筛选大于平均degree(度值)的靶标作为重要靶标。

1.4 GO生物功能富集分析与KEGG通路富集分析

为进一步阐明上述重要靶标蛋白的生物学功能和在信息调控中的作用，通过Metascape基因功能注释分析工具，默认P≤0.01，物种限定为Homo sapiens，选择Custom Analysis分析，进行GO生物功能和KEGG通路的富集分析。其中，GO生物功能分为细胞组成(cellular component，CC)、生物过程(biology process，BP)和分子功能(molecular function，MF)，使用联川生物云平台可视化富集结果。

2 结果

2.1 瘤果黑种草子活性分子的靶标预测、炎性反应相关靶标数据库建立

经文献挖掘整理，检索到60个潜在活性分子。借助Swiss Target Prediction预测靶标，去除“probability”为0的靶标，最终收集到57个活性分子的潜在靶标信息，3个活性分子未收录入该数据库。将靶标数据去重处理得到1 066条信息。通过多数据库、多关键词联合检索的方法，合并去重处理数据，共收集到1 938个炎性反应相关疾病的靶标信息。

经在线韦恩图软件Venny2.1.0分析，活性分子和炎性反应相关靶标的共同靶标有318个，这些共同靶标可能是瘤果黑种草子发挥抗炎作用的潜在作用靶标。如图1所示，蓝色component代表活性分子靶标数量，黄色disease表示疾病靶标数量。

图1 活性成分-疾病交集韦恩图Fig.1 Venn diagram of the activecomponent-disease intersection

2.2 重要靶标的筛选

由String得到蛋白互作网络图，图2中有318个节点，1 777条边，平均节点度11.2，平均局部聚类系数为0.538。边的粗细表示蛋白间作用的强弱。通过平均度值筛选出101个重要靶标。在网络中，节点(Node)表示靶标，节点之间的连线(Edge)代表靶标间的相互作用。某一节点的degree值(度值)定义为网络中该节点与其他节点连线的数目，度值大小反映了节点在网络中贡献度大小。通过度值筛选出排名前10的关键靶标，PIK3CA、STAT3、PIK3R1、APP、MAPK1、MAPK3、AKT1、SRC、CXCR4、TP53，提示这些靶标可能在瘤果黑种草子抗炎作用中起重要作用。

图2 共同靶标蛋白互作网络图Fig.2 Interaction network of common target proteins

2.3 活性分子-共同靶标网络构建分析

借助Cytoscape3.7.0构建活性分子-共同靶标的可视化网络。网络中含有375个点，2 440条边。平均每个活性分子对应42.80(2 440/57)个靶标，每个靶标平均连接7.67个活性分子(2 440/318)，由此推断，瘤果黑种草子的抗炎作用可能同时涉及一个活性分子对应多个靶标和一个靶标受多个活性分子干预的情况，体现了中药多组分、多靶标的药理作用特性。图中黄色箭头形状代表共同靶标，粉色圆形代表活性分子。靶标图形越大，表明其度值越大，提示其可能是网络中的关键节点(图3)。

图3 活性分子-靶标互作网络Fig.3 Active compound-target intersection network

2.4 GO生物功能富集注释

采用Metascape数据库对瘤果黑种草子的101个重要靶标进行基因本体(gene ontology，GO)富集分析2 354条，其中细胞组分(cellular component，CC)111条、分子功能(molecular function，MF)139条、生物过程(biological process，BP)2 104条。如表1，图4所示，瘤果黑种草子抗炎作用的潜在靶标主要存在于胞膜和蛋白质复合物。如表2，图5所示，分子功能富集结果提示，潜在靶标的分子功能主要有G蛋白偶联的胺受体活性(G protein-coupled amine receptor activity)、G蛋白偶联神经递质受体活性(G protein-coupled neurotransmitter receptor activity)、神经递质受体活性(neurotransmitter receptor activity)、血清素受体活性(serotonin receptor activity)等。如表3，图6所示，生物过程主要涉及机体对伤口的反应(response to wounding)、激酶活性的正调控(positive regulation of kinase activity)、转移酶活性的正调控(positive regulation of transferase activity)、MAPK级联反应的正调控(positive regulation of MAPK cascade)和细胞运动的正调控(positive regulation of locomotion)等。

表1 GO 细胞组分富集分析Table 1 GO cell component enrichment analysis

表3 GO生物过程富集分析Table 3 GO biological process enrichment analysis

2.5 KEGG通路富集注释

对瘤果黑种草子抗炎重要靶标进行全基因组及代谢途径(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，获得165条通路。如表4,图7所示，按照-LogP排序，排名靠前的有癌症通路(pathways in cancer)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染(kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、人类巨细胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、乙型肝炎(Hepatitis B)、癌症中的多糖(proteoglycans in cancer)等通路。其中Th17细胞分化通路(Th17 cell differentiation)与自身免疫疾病密切相关，-LogP值为28.02。

图4 GO 细胞组分富集分析Fig.4 GO cell component enrichment analysis

图5 GO 分子功能富集分析Fig.5 GO molecular function enrichment analysis

3 讨论

现代中药技术对瘤果黑种草子的研究覆盖了较多的研究领域，提示该药具有抗氧化、抗病毒、抗感染、肿瘤抑制和免疫调节等多种药理活性。瘤果黑种草子提取物可缓解LPS，木瓜蛋白酶所致大鼠COPD模型中的炎性细胞趋化、炎性因子水平升高，同时对急性酒精性肝损伤所致小鼠血液转氨酶水平升高、肝小叶结构破坏、肝细胞坏死也有保护作用[7,9]。其总黄酮提取物具有抗炎，镇咳作用，可以抑制大鼠棉球肉芽肿，延长喷雾致小鼠哮喘的反应潜伏期，抑制豚鼠离体肺支气管灌流实验和离体回肠实验中工具药物所致的平滑肌痉挛[12-13]。其总皂苷提取物能够抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀及角叉菜胶所致的足趾肿胀[14]，减少冰醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的增高，并对佐剂性关节炎的继发性损害及胶原诱导型关节炎损伤有明显的抑制作用[6]。上述研究显示，瘤果黑种草子的有效成分具有良好的抗炎作用，本文结合中医药的“整体观念”理论，分析瘤果黑种草子发挥多效抗炎作用的疾病靶标。上述研究显示，瘤果黑种草子的有效成分具有良好的抗炎作用，本文结合中医药的“整体观念”理论，分析瘤果黑种草子发挥多效抗炎作用的疾病靶标瘤果黑种草子用于治疗风湿病所致的关节痛，缓解关节滑膜的慢性炎性反应。在这类疾病中，Th17被认为是驱动疾病发展的关键因素[15]。Th17细胞分泌促炎细胞因子IL-17和IL-21，协同放大其他细胞因子的致炎作用，激活滑膜成纤维细胞和巨噬细胞，促进分泌更多炎性物质，从而作用于多种胞内通路发挥促进破骨细胞分化、促进骨基质降解、抑制骨生成等作用，加剧关节炎性反应[16]。本研究的重要靶标筛选和基因通路富集结果显示，与Th17细胞分化通路(Th17 cell differentiation)相关的基因有IL-6、IL-2、STAT3、STAT6、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、MAPK1、MAPK等。Th17细胞的分化需要促炎因子和核转录调控因子的参与，在IL-6和TGF-β协同作用下，被持续激活的STAT3可解除由Foxp3介导的维甲酸相关孤儿受体(RORγt)的表达抑制作用[17]。STAT3直接作用于IL-21前体，促进其产生。IL-21通过STAT3依赖的途径，诱导Th17细胞中RORγt表达增加和IL-17分泌[18]。由此可知，瘤果黑种草子极有可能通过作用于IL-6、SATA3等靶标减少Th17细胞产生IL-21和IL-17的炎性级联反应，从而发挥改善风湿病中关节炎性反应及继发性骨损伤的作用。

图6 GO 生物过程富集分析Fig.6 GO biological process enrichment analysis

表4 KEGG通路富集分析Table 4 KEGG pathway enrichment analysis

图7 KEGG通路富集分析Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis

COPD是持续性的气道炎性反应所造成的进行性不可逆的气道阻塞[19-20]。COPD患者中Th17相关细胞因子IL-17A、IL-22和IL-23的表达增加[21]。IL-17A不仅参与中性粒细胞募集过程，还诱导肺实质中巨噬细胞和树突状细胞产生促炎因子和趋化因子[22]。基于通路富集的结果，瘤果黑种草子可能通过影响Th17细胞的分化，进而影响IL-17A的分泌，在COPD的发展进程中起到抗炎治疗作用。

在富集的重要靶标中，CXCR是趋化因子受体，诱导免疫细胞的定向迁移、活化与发育，有研究显示在CXCR3配体诱导下COPD患者单核细胞和淋巴细胞的趋化性增加，这可能与COPD中CXCR3表达的增加相关[23]。COPD病理特征是嗜中性粒细胞浸润，因此由趋化因子/受体作用的细胞迁移至炎性反应区域也是导致炎性反应的机制之一。本文预测，瘤果黑种草子与CXCR的靶标关联性较强，提示瘤果黑种草子经由趋化因子受体途径减少细胞炎性迁移的作用也可能是其发挥抗炎作用的机制之一。

除此之外，从生物过程富集分析和通路富集结果来看，瘤果黑种草子的发挥抗炎作用的核心通路还很多，主要体现在抵抗外来微生物的反应、抗病毒、调控激酶激活通路以及应对伤口反应等多个方面。

综上所述，本文基于网络药理学的思路分析了瘤果黑种草子抗炎治疗类风湿性关节炎、COPD等疾病的机制，构建了瘤果黑种草子活性分子-潜在靶标网络，找到了IL-6、STAT3等关键基因及Th17、CXCR通路，为深入研究瘤果黑种草子发挥药理作用的新通路和新调控基因提供了依据。因该药物至今缺乏代谢产物的研究信息，故本文在有效物质基础的分析方面有一定的局限性；此外，本文分析得到的重要靶标及关键信号通路有待进一步的生物学实验验证。