草莓种苗根腐病病原菌鉴定及对14种杀菌剂的敏感性

姜莉莉，延义琳，宗晓娟，王晓芳，田中一久，武冲

(1.山东省果树研究所/山东省现代设施果树技术创新中心，山东 泰安 271000；2.金乡县高河街道办事处，山东 金乡 272212)

草莓(Fragaria ananassaDuch.)为蔷薇科草莓属宿根性多年生草本植物。其果实汁多味美、营养丰富，深受消费者喜爱，素有“水果皇后”的美誉。我国草莓种植面积和产量均位居世界首位，其中山东、河北、辽宁、江苏和四川是我国主要草莓产地[1]。在我国北方，草莓以设施栽培为主，高湿和连作易导致多种病害发生，严重影响草莓产业发展。根腐病是危害草莓的重要根部病害之一，属于典型的土传病害，防治难度较大。草莓根腐病具有较强的潜伏特性，症状一旦发生则蔓延迅速，导致草莓植株大面积死亡[2]。

生产上草莓主要通过种苗抽生匍匐茎苗进行无性繁殖[3]。种苗繁育是草莓生产的关键环节之一。种苗的健壮与否直接决定了草莓生产苗繁育数量，以及后期草莓的生长、产量和品质[4]。目前，对于草莓病害的研究多集中在生产阶段，关于种苗病害的研究报道较少。草莓种苗根腐病的发生直接影响草莓生产苗品质，进而影响定植后收益。

本研究从山东省沂源县采集‘章姬’草莓种苗根腐病病苗，对根腐病病原菌进行分离、纯化和菌种鉴定，同时评价其对14种常用杀菌剂的敏感性，以期为草莓种苗安全生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试感病植株

2022年3月1日，在山东省沂源县某草莓种苗繁育基地选取穴盘种苗30株，品种为‘章姬’。

1.2 供试药剂

95%氟硅唑原药、96%啶酰菌胺原药、95%咯菌腈原药，山东潍坊润丰化工股份有限公司；95%丙硫菌唑原药，山东海利尔化工有限公司；97%氟环唑原药、98%咪鲜胺原药、95%叶菌唑原药，安道麦辉丰(江苏)有限公司；98%氟醚菌酰胺原药、94%腈菌唑原药、96%嘧菌酯原药、98%肟菌酯原药、98%吡唑醚菌酯原药、95%己唑醇原药、97%苯醚甲环唑原药，山东省联合农药工业有限公司。

氟硅唑原药以环己酮溶解，其余13种原药以丙酮溶解，制备浓度为10×104mg/L的母液，于4℃保存备用。

1.3 病原菌的分离、纯化

采用病组织分离法[5]:将草莓种苗根部以无菌手术刀纵向剖开，切取病健交界组织(图1)，75%乙醇消毒10～15 s，无菌水冲洗3次。无菌滤纸吸干水分后，接种于PDA培养基平板上，25℃黑暗培养3 d。待菌落形成后，挑取边缘菌丝，接种于新的PDA培养基平板，进行菌株纯化。

图1 草莓种苗根腐病病部

根据柯赫氏法则[6]，将在PDA培养基上培养7 d的菌株连带培养基一同接种至‘章姬’草莓穴盘种苗茎基部，以无菌水处理为对照。进行常规管理，观察植株发病症状。

1.4 病原菌鉴定

取培养7 d的根腐病菌菌丝0.1 g，采用CTAB法提取基因组DNA，以ITS引物(ITS1/ITS4)进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收、纯化后，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测得序列与NCBI数据库中的序列进行BLAST比对，并采用MEGA 5.0软件构建系统发育树[7]。

1.5 室内毒力测定

采用生长速率法进行14种杀菌剂对草莓种苗根腐病菌的室内毒力测定。

在预试验的基础上，对供试药剂母液进行梯度稀释。咯菌腈的试验浓度为0.025、0.050、0.100、0.250、0.500 mg/L，咪鲜胺的试验浓度为0.100、0.250、0.500、1.000、2.500 mg/L，其余药剂的试验浓度均为0.500、1.000、2.500、5.000、10.000 mg/L。

在超净工作台上，取1.0 mL各浓度药液于49mL灭菌后冷却至50～60℃的PDA培养基中，混匀后制备3个含药平板。待平板完全凝固后，以直径7 mm打孔器在菌落边缘打取菌饼，倒置接种于PDA平板中央，以无菌水处理为对照。25℃黑暗培养，待对照菌落长至培养皿1/2～2/3时，以十字交叉法测定各处理菌落直径。按照如下公式计算各浓度药剂处理的菌丝生长抑制率(%)。

抑制率(%)＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径－菌饼直径)×100。

采用SPSS 18.0软件计算各药剂的菌丝生长EC50值和95%置信限。以抑菌活性最低药剂的EC50值为基准，计算各药剂的相对毒力指数。

2 结果与分析

2.1 草莓种苗根腐病病原菌分离

从草莓种苗病根髓心部位共分离得到12株真菌，根据菌落形态合并为5类，数量分别为7、2、1、1、1株，对其中菌落形态相同且数量占绝对优势的菌株(GF－1)进行后续试验，纯化后在PDA培养基平板生长的菌落形态如图2所示。菌落呈白色棉絮状，较厚实，有同心轮纹。菌丝生长速度中等，7 d左右菌落直径可至9 cm。后期产生褐色至黑色颗粒状分生孢子角，培养时间越长，分生孢子角越多。与温浩等[8]报道的草莓新拟盘多毛孢菌菌落形态相似。

图2 草莓种苗根腐病病原菌GF－1菌落形态

将纯化后的病原菌回接至‘章姬’草莓穴盘种苗上，14 d后叶片变红、植株长势弱(图3)，与原始症状相同。

图3 草莓种苗根腐病菌GF－1回接症状

2.2 草莓种苗根腐病病原菌分子生物学鉴定

采用ITS通用引物ITS1/ITS4对GF－1菌株DNA进行PCR扩增，得到长度为543 bp的DNA序列。将其在NCBI数据库进行BLAST比对，发现其与类拟盘多毛孢菌(Neopestalotiopsis)同源性最高，采用MEGA 5.0构建ITS序列系统发育树(图4)，发现其与Neopestalotiopsis mesopotamica(类拟盘多毛孢菌)聚在一枝。该菌株最早于1969年发现于伊拉克境内的土耳其松[9]，在草莓植株上为首次报道。

图4 草莓种苗根腐病菌ITS序列系统发育树

2.3 14种杀菌剂对草莓种苗根腐病菌菌丝生长的抑制率

由表1可以看出，咯菌腈对草莓根腐病菌的抑制活性最高，浓度为0.025～0.500 mg/L时，抑制率为22.21%～93.49%；其次为吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑，浓度为0.500～10.000 mg/L时，抑制率分别为29.82%～96.95%和23.94%～89.00%。咪鲜胺浓度为0.100～2.500 mg/L时，抑制率为30.83%～75.18%。浓度为0.500～10.000 mg/L时，氟硅唑和氟环唑的抑制率分别为16.44%～92.01%和8.90%～89.29%；氟醚菌酰胺、叶菌唑和己唑醇的抑制率分别为17.84%～73.60%、13.56%～78.75%和11.70%～73.31%；丙硫菌唑、啶酰菌胺、肟菌酯、嘧菌酯和腈菌唑的抑制率分别为24.06%～63.63%、10.39%～70.31%、13.19%～68.41%、15.56%～65.24%和7.01%～71.58%。

表1 14种杀菌剂对草莓种苗根腐病菌菌丝生长的抑制率

表1(续)

2.4 14种杀菌剂对类拟盘多毛孢菌的室内毒力

由表2可以看出，在14种供试杀菌剂中，腈菌唑对类拟盘多毛孢菌菌丝生长的室内毒力最低，EC50值为4.549 mg/L。以其为基准，计算其它药剂的相对毒力指数，咯菌腈对草莓种苗类拟盘多毛孢菌的室内毒力最高，EC50值仅为0.070 mg/L，较腈菌唑的相对毒力指数为64.986。吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑、咪鲜胺和氟硅唑的室内毒力也较高，EC50值分别为1.009、1.499、1.606、1.797 mg/L，相对毒力指数分别为4.508、3.035、2.833和2.531。氟环唑、氟醚菌酰胺、叶菌唑和己唑醇的EC50值分别为2.457、2.719、2.874、3.268 mg/L，相对毒力指数分别为1.851、1.673、1.583和1.392。丙硫菌唑、啶酰菌胺、肟菌酯和嘧菌酯对类拟盘多毛孢菌的室内毒力相对较低，EC50值分别为3.794、4.013、4.407、4.514 mg/L，相对毒力指数分别为1.199、1.134、1.032和1.008。

表2 14种杀菌剂对类拟盘多毛孢菌菌丝生长的室内毒力

3 讨论与结论

草莓种苗繁育高峰期主要集中在5—8月，高温多雨极易引起病害蔓延。草莓根腐病是由土传病原真菌侵染引起的重要根部病害之一[10]。本研究从‘章姬’草莓种苗根腐病病根髓心部位分离得到多株病原菌，经形态学和分子生物学鉴定，该病原菌为类拟盘多毛孢菌(Neopestalotiopsis mesopotamica)。

类拟盘多毛孢菌的寄主范围较广，可侵染月季、牛油果、碧根果等。侵染草莓可引起红叶病，发病初期叶片为红色，后期整株萎蔫、死亡，对‘甜查理’等品种的危害尤其严重[11]。近年来，该属病原菌危害草莓的报道逐渐增多，可引起草莓叶斑病、根腐病、茎腐病等多种病害[12，13]，但在‘章姬’种苗上为首次报道。

目前，化学杀菌剂仍是防治草莓病害的主要手段。然而，《中国农药信息网》显示，防治草莓根腐病的产品仅包括熏蒸剂棉隆和生防菌剂，尚无获得登记的化学药剂。本研究选取14种常用化学杀菌剂，对分离得到的类拟盘多毛孢菌进行室内毒力测定，发现咯菌腈的抑菌活性最高，EC50值仅为0.070 mg/L，较腈菌唑的相对毒力指数为64.986；吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑、咪鲜胺和氟硅唑的室内毒力也较高，EC50值分别为1.009、1.499、1.606、1.797 mg/L。

咯菌腈属于苯吡咯类杀菌剂，为假单胞菌代谢产物硝吡咯菌素的类似物，其杀菌谱较广，但不具有内吸性[14]。吡唑醚菌酯为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，通过阻碍真菌线粒体呼吸而抑制病原菌孢子萌发和菌丝生长[15]。苯醚甲环唑和氟硅唑均为三唑类杀菌剂，具有保护、治疗和内吸活性。其中，苯醚甲环唑通过干扰病原菌细胞C14脱甲基化作用、抑制病原菌麦角甾醇的生物合成、破坏细胞膜的生理作用从而导致真菌死亡[16]；氟硅唑具有较强的渗透性[17]。生产上，上述药剂均可用于草莓种苗根腐病的防治，但需合理轮用和混用，以延缓抗药性的产生。