长角血蜱巨噬细胞移动抑制因子的克隆表达及酶活分析

王玉俭，代绍密，李晓燕，黄冰冰，宋冠华，钟平生

（惠州学院 生命科学学院，广东 惠州 516007）

蜱是一类常见的寄生于脊椎动物体表的吸血节肢动物，它们侵袭哺乳动物、鸟类、爬行类，甚至两栖类，广泛分布于世界各地。蜱隶属蛛形纲，蜱螨亚目，蜱总科。蜱总科包括硬蜱科，软蜱科和纳蜱科；硬蜱科是常见的且危害最大的一种，其次是软蜱科，纳蜱科则不太常见且影响不大。蜱的危害不仅是作为动物外寄生虫，更重要的是作为许多人和动物重要疾病的传播媒介。蜱是世界范围内仅次于蚊子的第二大疾病传播媒介，可以传播病毒、细菌、真菌和原虫等多种病原体。蜱是人森林脑炎、Q 热和莱姆病等传染病的主要传播媒介，给公众卫生的安全带来严重的危害。蜱及蜱传病对畜牧业造成的经济损失也十分巨大，据联合国粮农组织（FAO）数据统计显示，仅硬蜱给畜牧业造成的损失，每年高达70亿美元以上［1］。

巨噬细胞移动抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一个重要的哺乳动物炎症介质［2］。MIF 在哺乳动物中有着广泛和恒定的表达，它们被发现表达在许多组织和细胞类型中，包括：T 细胞、嗜酸性粒细胞、纤维母细胞及单核巨噬细胞［3-4］。缺乏通过内质网和高尔基体的经典分泌途径所需的N端信号肽，MIF 通过无需信号肽介导的非经典途径分泌［5］。MIF 是一个在进化上较为古老的分子，与哺乳动物同源的MIF 同系物基因被发现存在于许多原核（如细菌）和真核（如植物，鱼类、两栖类、鸟类和哺乳动物等脊椎动物，及原虫、蠕虫、线虫、软体动物和节肢动物等无脊椎动物）生物。许多寄生生物的MIF 同系物先后被鉴定，一些研究表明它们的功能可能是通过操纵宿主的免疫系统以帮助寄生虫逃避宿主的免疫应答，最终帮助寄生虫成功的入侵和定殖于宿主。

不同蜱种的MIF 同系物陆续被鉴定［6-11］，然而它们确切的生物学功能仍需要进一步的研究。本研究克隆和表达长角血蜱这一巨噬细胞移动抑制因子基因（HlMIF），生产重组蛋白并测定其互变异构酶活性，为更好地理解HlMIF的生物学功能提供基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

Trizol试剂、反转录试剂盒、限制性内切酶、T4连接酶、pMD19-T 载体连接试剂盒和2×Taq Master Mix 购自南京诺唯赞生物科技有限公司；胶回收和质粒提取试剂盒购自北京天根公司；DH5α 和BL21（DE3）感受态细胞购自南京擎科生物技术有限公司；卡那霉素、氨苄霉素、IPTG 和盐酸左旋多巴甲酯购自Sigma 公司；His 色谱层析柱购自Novagen 公司；pET-28a 质粒保存于实验室。

1.2 HlMIF基因的克隆

采用Trizol法进行长角血蜱半饱血成虫总RNA的提取，然后按照cDNA 反转录试剂盒说明书合成模板cDNA。根据HlMIF（GenBank 登录号：AB255601.1）的核苷酸序列信息，使用Primer Premier 5.0 软件设计扩增其开放阅读框（ORF）的特异性引物，HlMIF F：5′-GCGAATTCATGCCAACTCTCACGATT-3′；HlMIF R：5′- GACTCGAGCCCAGCAAATGTTTTTCC -3′，并引入酶切位点EcoR I和Xho I（下划线），引物由安徽通用生物公司合成。以合成的半饱血雌蜱cDNA为模板，F与R 为引物进行HlMIF 基因的PCR 扩增。反应体系（25 μL）：2×Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1.5 μL，cDNA 模板2 μL，dd H2O 7.5 μL。反应条件：94 ℃5 min；94 ℃34 s，53 ℃34 s，72 ℃1 min 共35 个循环；72 ℃7 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检验。PCR产物连接到pMD19-T载体上，经双酶切鉴定和测序，阳性克隆命名为pMD19-T-HlMIF。

1.3 HlMIF原核表达体系的构建

将重组克隆质粒pMD19-T-HlMIF 和表达载体pET-28a 分别用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，回收目的片段，用T4 DNA 连接酶连接，转化至BL21（DE3）感受态细胞。PCR 和测序确认阳性克隆，将其命名为pET-28a-HlMIF。取含正确重组表达质粒的菌液100 μL接种到10 mL含卡那抗性的LB液体培养基中，37 ℃200 r/min振荡培养2.5 h左右使菌液OD值达到0.4~0.6，取出1 mL菌液后加入IPTG（终浓度为1 mmol/L）进行诱导，期间每隔1 、2、3、4 、5 h 各取1 mL 菌液，制备样品，进行SDS-PAGE，确定重组蛋白的最佳诱导时间。

1.4 重组蛋白的表达纯化

参照说明书使用His 蛋白纯化柱对重组蛋白质进行纯化，经SDS-PAGE检测后，将纯化好的重组蛋白在PBS缓冲液中透析24 h，PEG 20 000浓缩后，测定浓度，过滤除菌分装，-70 ℃冻存。

1.5 HlMIF重组蛋白互变异构酶活性分析

为制备L 多巴色素甲酯（L-dopachrome methyl ester），将8 mmol/L的高碘酸钠与4 mmol/L的盐酸左旋多巴甲酯（L-3，4-dihydroxyphen ylalanine methyl ester）等体积混合，室温放置5 min，然后冰浴20 min。加入180 μL 上述混合液至96 孔板中，加入5 μmol/L（终浓度）的rHlMIF，立即送至酶标仪，在25 ℃下读取475 nm波长的吸光度值15 min（30 s间隔一次）。

2 结果

2.1 HlMIF的克隆

以半饱血成蜱cDNA为模板扩增HlMIF基因，获得351 bp左右的目的片段（图1），与预期大小一致。

图1 HlMIF RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳

构建pMD19-T-HlMIF重组质粒经PCR鉴定正确，通过测序，与参考序列（GenBank登录号：AB255601.1）同源性为100%。生物信息学分析发现HlMIF推导的氨基酸序列中存在保守的互变异构酶活性位点（图2）。

图2 HlMIF核苷酸和推导的氨基酸序列

2.2 HlMIF的原核表达

将HlMIF 基因片段克隆至pET-28a 载体，重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG 诱导后经SDSPAGE 检测。结果显示，重组蛋白大小约为17.4 kDa，IPTG诱导后在5 h后表达量达到最大（图3）。

图3 SDS-PAGE分析pET-28a-HlMIF的时相表达

2.3 HlMIF重组蛋白的纯化

诱导表达的菌体超声破碎后通过Ni2+亲和层析纯化重组蛋白。SDS-PAGE 分析结果显示，rHlMIF 融合蛋白以上清的形式存在；经镍柱纯化后，得到了较纯净的融合蛋白rHlMIF（图4）。

图4 SDS-PAGE分析重组蛋白rHlMIF的纯化结果

2.4 HlMIF重组蛋白互变异构酶活性分析

以L多巴色素甲酯为底物对HlMIF重组蛋白的互变异构酶活性进行分析。结果显示，HlMIF 重组蛋白具有对底物L多巴色素甲酯的互变异构酶活性（图5）。

图5 HlMIF重组蛋白的互变异构酶活性

3 讨论与结论

不同于软蜱的重复多次的较短时间（数分钟）吸血，硬蜱在每一发育阶段需要对同一宿主长时间的吸血（数天到数周）。在这一长时间的吸血过程中，势必会激发宿主一系列的防御机制：（1）血管收缩和启动凝血途径防止血液的流失；（2）触发炎症反应和补体的激活等先天性免疫反应以应对随之而来的微生物感染和帮助受损组织的重塑；（3）再次被同一蜱种叮咬的宿主可触发抗原特异性获得性免疫。在与宿主长期的共进化中，蜱获得了突破宿主这些防御机制的能力［12］。在蜱的唾液腺中存在一系列具有抗凝血、抗炎症和具有免疫调节特性的生物活性分子。为了完成持续的吸血，含有这些生物活性分子的唾液会被蜱释放到宿主体内，以对抗宿主的各种防御机制［13］。许多研究表明，在克服宿主的凝血和免疫防御反应方面，蜱唾液中的这些生物活性分子发挥了十分关键的作用，最终帮助蜱虫完成吸血和发育［14-17］。蜱唾液的组分是相当复杂的，且在功能上具有冗余性；这也正对映了宿主防御机制的复杂和冗余性。一些蜱唾液分子已被鉴定，对它们的功能也有所研究，然而绝大多数的蜱唾液分子的功能仍保持未知［18-19］。

鉴于蜱唾液分子具有广泛的生物学活性，它们在医药生物制剂开发上表现出的价值显著提升。许多蜱唾液分子被期待开发为缓解和治疗如凝血功能紊乱、肿瘤和自身免疫性疾病等疾病的生物制剂。重组白毛钝缘蜱TAP（Tick anticoagulant peptide）蛋白已被用于许多静脉和动脉粥样硬化实验动物模型的治疗中，研究发现都可取得不同程度的效果［20-24］。肩突硬蜱的Ixolaris（一个组织因子抑制剂）被认为具有治疗人恶性胶质瘤的潜在价值，它可以在恶性胶质瘤模型中抑制原发性肿瘤的增长和血管生成［25］。血红扇头蜱的Evasin-1，一个可高亲和度与宿主的CCL3 和CCL4 特异性结合的趋化因子结合蛋白。在CCL3 依赖的博来霉素诱导的肺损伤模型中，Evasin-1 可显著降低白细胞渗出、组织纤维化程度及致死率［26-27］。该蜱种的另一个趋化因子结合蛋白Evasin-3，可结合小鼠和人的CXCR2 配体（IL-8）。在由抗原诱导的关节炎模型中，Evasin-3可显著减少关节腔内中性粒细胞的渗出及局部TNF-α 的分泌水平［28］。作为蜱虫这一体外寄生虫所表达的哺乳动物宿主细胞因子同系物，HlMIF 可能在其自身和宿主体内都发挥着非常关键的作用。

本研究成功克隆和表达了HlMIF基因并获得纯度较高上清表达的重组蛋白。互变异构酶活性分析结果显示，rHlMIF 具有对底物L 多巴色素甲酯的互变异构酶活性，表明表达的重组HlMIF 蛋白具有很好的生物学活性，为更好地理解HlMIF的生物学功能奠定了基础。