基于16S rDNA 测序技术研究惠州市水产养殖中的耐药菌

冀 霞，黄奕睿，余若菁，李旭康，朱康溢，郭铭娜

（惠州学院 生命科学学院，广东 惠州 516007）

惠州市作为粤港澳大湾区重要的临海城市，海洋和淡水资源丰富，水产养殖占据重要地位。《2019 中国渔业统计年鉴》显示，广东省水产总产量866.40 万t，跃居全国第一。2022 年上半年惠州市地区生产总值增速全省第一［1］，水产养殖业发展尤其迅猛，伴随着养殖集约化程度、养殖密度和水产品总量不断攀升，随之出现的水质环境恶化、疾病暴发流行、病原微生物耐药性增强及水产品质量安全等问题也日益突出［2］。

使用抗生素是目前解决水产品病害的主要手段［3］。由于缺乏科学指导，很多养殖户存在滥用抗生素的情况，这不仅对病害收效甚微，还会导致环境中的抗生素逐渐积累，使细菌在选择压力下被诱导产生耐药性［4］。张骞月等［5］对南美白对虾养殖池塘中磺胺类药物的残留分析，表明磺胺类药物残留浓度大，且药物的浓度变化与养殖活动密切相关。宁丹等［6］对广东省养殖鱼类无乳链球菌耐药性进行了研究，发现它对多达12种抗生素都有不同程度的耐药率，其中对链霉素和庆大霉素的耐药率更是达到100%，有些菌株甚至表现出多重耐药的现象。对比广东省以外地区养殖产业水生动物耐药菌情况，也能看出不同地点耐药菌对抗生素的敏感程度有所差异，可见，水产养殖抗生素耐药菌防治情况不容乐观，细菌耐药性增强、耐药基因的扩散问题依旧不容忽视［7］。

目前，针对惠州等小区域水产养殖水体中细菌耐药性情况的研究报道较少，不同地区来源菌株对抗生素的敏感程度有很大差异。因此，通过研究分析惠州水产养殖水体中细菌的耐药性情况，为惠州市水产品的疾病控制及养殖水体中的细菌耐药性影响提供重要参考依据。

16S rDNA 测序常用于确定特定微生物群体的菌属组成。常规检测的方法是从细菌形态和生化水平检测，很难鉴定出细菌的种属，而用16S rDNA 测序方法可以更准确鉴定出菌的种属。MOORE 等［8］曾经采用16S rDNA PCR、基因检测技术，测定鲑鱼养殖场水体中细菌病原体的多样性和抗生素耐药性，确定了不动杆菌属、气单胞菌属等7 个不同属的10 个分类群。因此，通过16S rDNA测序鉴定惠州市水产养殖环境中微生物病原体，能更好地把控地区水产养殖病原性耐药菌的种属组成。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

LB 培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；抗菌药物购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Taq酶、DNA ladder 购自大连Takara 公司；16S rDNA 通用引物［9］（27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT - 3'）合 成 和DNA 测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 样品的采集和准备

随机选取惠州市3 个县（区）内4 个水产养殖点进行采样，分别是A：惠城区惠州市渔业研究推广中心；B：惠城区湖心岛休闲钓鱼场；C：博罗县泰美镇芹塘村水产养殖点；D：惠阳区叶挺纪念馆水产养殖点。以惠州市渔业推广中心和博罗县泰美镇芹塘村为代表，4个水产养殖点的养殖鱼类均为混养淡水鱼类，以草鱼和罗非鱼为主，水产养殖水体环境细菌耐药情况具有代表性。在采样点随机选取2 个不同的位置采集水样，将50 mL 的离心管伸入水下15～25 cm 处，打开管盖使水自然浸满管子，在水下拧紧瓶口。将采集的水样保存于4 ℃，并在8 h内进行后续实验分析。

1.3 耐药菌株分离培养

分别取100 mL 水样。用PBS 缓冲液10 倍梯度稀释后，取100 uL 用涂布法分别涂布于2 组不同种类抗生素，包括氨苄西林（Ampicillin，Amp，100 g/mL）、庆大霉素（Gentamicin，Gen，10 g/mL）、四环素（Tetracycline，Tet，12.5 g/mL）和氯霉素（Chloramphenicol，Cm，30 g/mL）、卡那霉素（Kanamycin，Kan，25 g/mL）、诺氟沙星（Norfloxacin，Nor，4 g/mL）的固体LB 培养皿上，不含抗生素的LB培养板做对照，每组3个平行。将培养基分组置于28 ℃和37 ℃的培养箱倒置培养16～18 h，计算各种抗生素培养基上的菌落数，并表示为菌落形成单位CFU/mL，平均2 个相邻稀释梯度的值，然后同无抗性LB 平板上的菌落对比，得到细菌的耐药率（CFU=n1=第一平板克隆个数，n2=第二平板克隆个数，n3=第三平板克隆个数，c=稀释梯度），用GraphPad prism进行数据分析，并根据菌落的形态特征挑选出不同菌株进行保种。

1.4 细菌基因组DNA的16 S rDNA的PCR扩增与鉴定

根据菌落的形态特征，随机从各个平板中挑出不同菌落，进行PCR扩增。PCR反应体系：2.5 uL 10×Ex Taq Buffer，2 uL dNTP Mixture（2.5 mmol/L），引物27F（10 umol/L）、引物1 492R（10 umol/L）各0.5 uL，0.2 uL TaKaRa Ex Taq HS（5 U/uL），1 uL 的DNA 模板，补ddH2O 至25 uL；反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1.5 min，30 个循环；72 ℃终延伸5 min。

1.5 16S rDNA 的测序及系统发育进化树构建

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳验证后，挑取阳性扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果在NCBI数据库中选择blast进行同源性比对，并基于MEGA 软件用近邻法（Neighbor-Joining）构建耐药菌的系统发育树，在MEGA 主窗口菜单栏中选择“Phylogeny"，再选择Construct/Test Neighborjoining Tree，系统进化树，导出结果。

2 结果与分析

2.1 耐药菌分布和耐药菌耐药率分析

在惠州市范围内的3个县/区随机选取4个采样点（图1）。将各采样点水样梯度稀释，涂布于含不同抗生素的固体培养皿上，并在28 ℃与37 ℃下培养16 h，对长出的菌落进行计数。

图1 惠州市水样采集分布图

对菌落计数的结果显示，在28 ℃的培养条件下，A采样点分离的菌对氨苄西林以及诺氟沙星的耐药率高达59.2%和53.74%；其次是对四环素和卡那霉素的耐药率，分别为14.9%和8.1%；对庆大霉素的耐药率为2.4%；对氯霉素的耐药率最低为0.3%；B点分离出来的菌，对氨苄西林以及诺氟沙星抗生素的耐药率则分别为40.4%和15.7%，对卡那霉素和四环素的耐药率为5.9%和1.4%，对庆大霉素和氯霉素的耐药率为0.4%和0；C 点分离出的菌对诺氟沙星、氨苄西林和卡那霉素的耐药率达到29.5%、21.4%和20.2%，对四环素和庆大霉素的耐药率分别为16.2%和5.7%，对于氯霉素的耐药率是0.1%。D点分离的菌对氨苄西林和诺氟沙星的耐药率高达75%和63.3%，对于四环素耐药率为5%，而对卡那霉素，庆大霉素、氯霉素的耐药率均低至0（图2）。

图2 不同采样点不同种类抗生素在28 ℃下的耐药率

在37 ℃的培养条件下，A采样点分离出的细菌对诺氟沙星和氨苄西林的耐药率分别为59.5%和57.8%，对四环素、庆大霉素和卡那霉素的耐药率为13.94%、9.7%和9.3%，对氯霉素的耐药率为0。B 点分离出来的菌对氨苄西林的耐药率为44.6%，对诺氟沙星的耐药率为27.1%，而对四环素和卡那霉素的耐药率分别为2.2%和0.9%，对庆大霉素和氯霉素的耐药率分别为0.3% 和0。C 点分离的菌对诺氟沙星耐药率为53.64%。对氨苄西林的耐药率19.3%，对卡那霉素的耐药率为13.6%，对四环素的耐药率为12.2%，对庆大霉素和氯霉素的耐药率则为0.1%。D点分离培养的菌对氨苄西林和诺氟沙星的耐药率分别为14.5%和13.8%，对四环素和庆大霉素的耐药率则是0.7%，对卡那霉素和氯霉素的耐药率为0（图3）。

图3 不同采样点不同种类抗生素在37 ℃下的耐药率

2.2 16S rDNA系统进化分析

分别在28 ℃和37 ℃条件下，不同抗性实验组的平行平板上，随机选取5 株形态不同的菌株，经16S rDNA序列，得到46株菌株序列。比对结果显示，此46株菌株分别属于8 种不同菌属（表1）。

表1 养殖水体的耐药菌的16S rDNA的同源性对比

通过对16S rDNA 基因序列构建系统发育树（图4），发现样品中最多的30 株属于气单胞菌属（Aeromonas）；丛毛单胞菌属（Comamonas）分离得到7株；不动杆菌属（Acinetobacter）分离得到2 株；拉乌尔菌属（Raoultella）分离得到2株；艾氏菌属（Escherichia）分离得到2 株；短稳杆菌属（Empedobacter）分离得到1株；假单胞菌属（Pseudomonas）分离得到1株；克雷伯氏菌属（Klebsiella）分离得到1株。

图4 基于16S rDNA序列的系统进化树

2.3 耐药菌的分离及16S rDNA的序列分析

从分离出的菌株发现，产气单胞菌属（Aeromonas）有65.22%，丛毛单胞菌属（Comamonas）有15.21%，不动杆菌属（Acinetobacter）有4.34%，拉乌尔菌属（Raoultella）有4.34%，艾氏菌属（Escherichia）有4.34%，短稳杆菌属（Empedobacter）有2.17%，假单胞菌属（Pseudomonas）有2.17%，克雷伯氏菌属（Klebsiella）有2.17%（图5A）。其中，产气单胞菌属耐药的抗生素为氨苄西林、卡那霉素、四环素、庆大霉素、诺氟沙星；丛毛单胞菌属对卡那霉素、庆大霉素具有耐药性，同时对氨苄西林和卡那霉素联合用药有着较高的耐药性；不动杆菌属对四环素、氯霉素具有耐药性；拉乌尔菌属对氨苄西林具有耐药性；艾氏菌属对四环素和氯霉素具有耐药性；短稳杆菌属对庆大霉素具有耐药性；假单胞菌属对氯霉素具有耐药性；克伯雷氏菌属对四环素具有耐药性（图5B）。

图5 基于16S rDNA序列分析的惠州市养殖水体菌属组成

从图6 可以看出，在所有对氨苄西林耐药的菌株中，产气单胞菌属（Aeromonas）的耐药率最高，为81.8%，拉乌尔菌属（Raoultella）的耐药率为18.2%；对诺氟沙星耐药的菌株全部属于产气单胞菌属，耐药率为100%；在对卡那霉素耐药的菌株为丛毛单胞菌属和产气单胞菌属，耐药率均为50%；对四环素耐药的菌株50%属于产气单胞菌属（Aeromonas），不动杆菌属（Acinetobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、和艾氏菌属（Escherichia）耐药率均为16.7%；而对氯霉素耐药的有假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌（Acinetobacter）和艾氏菌属（Escherichia）耐药率各为33.4%；对庆大霉素耐药最高的为产气单胞菌（Aeromonas），耐药率为60%，其次是丛毛单胞菌属（Comamonas）和短稳杆菌属（Empedobacter）耐药率各为20%；对氨苄西林和卡那霉素联合用药具有耐药性的菌属有产气单胞菌属和丛毛单胞菌属，耐药率分别为44.5%和55.5%。

图6 不同抗生素耐药菌属组成

3 讨论与结论

水产养殖过程中无法隔绝外部环境，因此，耐药菌和耐药基因将向外扩散，带来养殖环境不断恶化，从而使水产养殖品的抗病力下降，死亡率提高［10］。有研究者分离省外淡水养殖动物源的菌株，得到最主要的病原菌为产气单胞菌属的嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和温和气单胞菌等［11］，其次为少量的假单胞菌属、不动杆菌属、柠檬酸杆菌和弧菌属等潜在致病菌［12］。与上述研究结果相似，本研究中产气单胞菌属（65.22%）数量最多；但从惠州市养殖水体中分离出了与文献中不同菌属的不常见致病菌，有丛毛单胞菌属（15.21%）、拉乌尔菌属、短稳杆菌属和克雷伯氏菌属等。

产气单胞菌是一种广泛分布于水生环境中的革兰氏阴性细菌，在淡水环境中极其普遍，在水温上升时期，产气单胞菌会急速繁殖，在人类和动物中定居并感染，引发人类、鱼类和其他水生动物的细菌疾病［13］。此类菌属中的嗜水气单胞菌是水产养殖中常见病原菌，它携带溶血素、细胞毒素和肠毒素等多种毒力基因，感染叉尾鮰、黄颡鱼等水生动物引发溶血性败血症和人类腹泻［14］，造成水生动物的批量死亡和经济损失。朱永肖［15］调查河南沿黄渔区气单胞菌耐药性，结果显示产气单胞菌对青霉素和氨苄西林的耐药率均为100%，对四环素、强力霉素和萘啶酸的耐药率均超过了30%。实验结果与文献一致，该细菌对氨苄西林和诺氟沙星都具有较强的耐药性，但对诺氟沙星耐药的菌株全部是产气单胞菌。

惠州市4 个采样点3 个地区对氨苄西林和诺氟沙星的耐药率最高，其主要原因是由于这2 类抗生素的应用比较广泛，长期使用使其产生了大量的耐药菌。细菌耐药程度与养殖水平、养殖模式和用药习惯有关。博罗县地处惠州北部，相对偏远，农村以小规模鱼塘养殖为主，养殖户养殖品种和抗菌药物的使用不统一，这也可能是博罗地区与其他3个地区细菌的耐药性存在一定差异的原因。

综上所述，惠州市主要水产养殖区水体中的细菌总耐药率水平较高，其中对抗生素氨苄西林和诺氟沙星的耐药率高，对四环素、氯霉素耐药率较低。但是氯霉素同时能作用于人体线粒体从而引起人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症等疾病，我国2002 年出台《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》（193 号公告），将氯霉素列入禁用清单，禁止在所有食品动物上使用。因此，在水产养殖过程中，不能使用氯霉素，尽量避免用氨苄西林和诺氟沙星类抗生素，可以将耐药率低的四环素作为水产养殖的首选药物。