基于专利网的中药防治糖尿病核心药组挖掘及其分子作用机制研究*

潘建辉 ，孙星怡 ，刘畅 ，董雨蓉 ，王朔 ，，赵佳

（1.天津市胸科医院，天津 300222；2.天津中医药大学，天津 301617；3.天津医科大学，天津 300203）

糖尿病（DM）是一种由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗，导致血糖水平升高的慢性代谢性疾病。在过去的30年里，全球糖尿病患病率翻了两倍，据国际糖尿病联盟估算，预计到2023年，全球将有6.43亿糖尿病患者，而到2045年，糖尿病患病人群将增至7.83亿[1-2]。糖尿病的高患病率及其并发症带来的致残率给社会带来巨大经济负担，根据世界卫生组织（WHO）的统计，2019年约有150万例死亡直接归因于DM[3]。糖尿病分为1型和2型糖尿病，其中2型糖尿病占总比的90%，通过口服二甲双胍联合吡格列酮、磺脲类药物、氯茴苯酸和α-葡萄糖苷酶抑制剂等其他降糖药物进行治疗，但目前的DM疗法不易实现长期血糖控制，且对于胃肠道、心血管时间的不良反应和局限性尚不明确[4-5]。中医药在防治糖尿病方面历史悠久，根据患者多饮、多食、多尿及消瘦的症状，归属于“消渴病”范畴，以“益气、养阴、清热”为主要治法，并以葛根芩连汤、大柴胡汤、白虎加人参汤等经典名方进行辨证论治[6]。中药复方联合西药在防治糖尿病过程中具有良好作用，可通过抑制炎症反应、降脂、调节肠道菌群紊乱等作用改善胰岛素抵抗，发挥降糖的临床疗效，因此防治糖尿病的研究逐渐成为中医药领域研究热点之一[7-8]。基于糖尿病发病机制复杂性和中药多靶点多途径的药理作用特点，对于中医药防治糖尿病的基础研究及临床转化尚需进一步挖掘和探究[9-10]。

专利信息服务平台简称专利网，收载不同领域科学技术发展的最新专利信息，反映各领域发明创造的最新动态，根据专利网对中药组方规律、中药新药研发等中医药领域相关数据进行分析，能更精确掌握中医药临床和科研发展方向，揭示中医药行业布局和研发态势，为中医药防治不同疾病提供新的研究思路。本研究应用数据挖掘联合网络药理学的方法对专利网治疗糖尿病的中药处方的用药规律进行统计分析，并从“疾病-药物-化学成分-关键靶点-功能分析”角度阐明核心中药防治糖尿病的作用机制，为中药复方防治糖尿病的临床应用提供理论依据，并为后期开展核心相关中药复方防治糖尿病作用机制的临床研究提供前期基础，同时为揭示中医药防治糖尿病科学内涵的相关研究提供思路。

1 资料与方法

1.1 资料来源 登录中国专利信息中心专利之星检索系统（https：//www.patentstar.com.cn/），以糖尿病为检索词，收集所有中药治疗糖尿病的信息。

1.2 数据处理

1.2.1 纳入及排除标准 纳入所有以中药或中西医结合防治糖尿病及糖尿病相关并发症（糖尿病性肾病、糖尿病足、糖尿病心血管并发症、糖尿病性脑血管病、糖尿病神经病变等），且处方药物详细的专利。剔除有关保健品、营养粥、代餐、功能饮料，并未明确方药有效的专利。

1.2.2 数据录入及管理 将通过纳入标准筛选所得的方药录入Microsoft Excel表中，以《中药学》《中华本草》《中国药典》2015年版为参考，剔除未出现在上述参考书中的中药，并对中药名称进行规范，统计已录入中药及其四气五味、归经及功效分类的频次。

1.2.3 数据的相关性分析 使用SPSS Modeler 18.0，设置最大前项数为2，置信度60%，支持度10%，根据Apriori算法进行关联规则分析。使用SPSS statistics 22.0对使用频数排名前25的中药进行系统聚类分析，统计高频药物的常用配伍。

1.3 生物信息学方法对预测方剂的深度分析 将预测得到的高频药组，通过TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）平台筛选每味中药的有效成分，并以糖尿病（diabetes mellitus）为关键词在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org）、TherapeuticTargetDatabase（TTD）数据库（http：//db.idrblab.net/ttd）、OMIM数据库（http：//omim.org）数据库检索相关靶点，在Cytoscape 3.7.1中构建药物-成分-靶点-疾病网络图，通过STRING（https：//string-db.org）联合Cytoscape 3.7.1平台绘制蛋白互作网络图（PPI），并利用进行优化及绘制，采用R4.0.2软件将GO功能和KEGG通路可视化，最后通过分子对接，以预测专利网中防治糖尿病高频方药的潜在作用机制。

2 结果

2.1 中药频次统计 对纳入的2 056个中药处方进行统计，共23 625味中药，其中单个药物使用频次大于200的有25味，占比47.2%，使用频次由高到低依次为：黄芪（1002）、地黄（799）、山药（739）、葛根（724）、麦冬（592）等，见表 1。

表1 治疗糖尿病的中药使用频次（＞200次）Tab.1 Usage frequency of traditional Chinese medicine in the treatment of diabetesmellitus(＞200 times)

2.2 中药四气五味统计 对录入的2 056个中药处方进行统计，共23 625味中药、四气频次为23 625次，五味频次为38 291次，四气频次及比例具体见表2，图1A。五味频次及比例具体见表3，图1B。

图1 治疗糖尿病的中药四气五味统计图Fig.1 Statistical diagram of four qiand five flavour of traditional Chinese medicine for diabetes mellitus

表2 中药四气统计表Tab.2 Statistical table of TCM four qi

表3 中药五味统计表Tab.3 Statistical table of five flavors of TCM

2.3 中药归经统计 根据《中华本草》，对纳入的23 625味中药进行归经统计，实际统计23 207味中药，归经频次为62 719次，其中肺经11 871次，18.93%；肝经10 303次，16.43%；肾经9 931次，15.83%；脾经9 320次，14.86%；胃经8 204次，13.08%，见图 2。

图2 治疗糖尿病的中药归经统计图Fig.2 Statistical chart of menstruation of Chinese herbs in the treatment of diabetes mellitus

2.4 中药功效分类统计 根据第十版中药教材，对23 696味中药进行分类统计，实际统计20 498味中药，其中补虚药7 700次（补气药3 567次，补阴药2 549次，补阳药851次，补血药733次），37.56%；清热药3 898次，19.02%；解表药1 440次，7.03%；收涩药1 349次，6.58%；活血化瘀药1 341次，6.54%；利水渗湿药1 326次，6.47%；其余见图3、图4。

图3 治疗糖尿病的中药分类统计图Fig.3 Statistical figure of TCM classification for diabetes mellitus

图4 治疗糖尿病的补虚药统计图Fig.4 Statistical chart of tonic herbs for diabetes mellitus

2.5 中药功效统计 统计纳入的23 696味中药所有功效，共统计功效频次74 665次，排名前5的功效频次及比例依次如下：生津止渴1 699次，2.28%；清热解毒1 486次，1.99%；清热泻火1466次，1.96%；生津养血1362次，1.82%；利水消肿1357次，1.82%等，其余出现600次以上的功效见表4。

2.6 中药关联规则 对纳入的12 123味中药使用SPSS modeler 18.0进行关联规则分析，设置最大前项数为2，置信度60%，支持度10%，高频使用药对：黄芪-地黄 799，黄芪-山药 739，黄芪-葛根 724，地黄-麦冬592，黄芪-麦冬572；常用的中药配伍共纳入5条两项：黄芪-地黄；黄芪-山药；黄芪-葛根；地黄-麦冬；黄芪-麦冬；3条3项关联组：地黄-山药、黄芪；黄芪-山药、地黄；黄芪-麦冬、地黄。见表5。

表5 治疗糖尿病药物关联规则分析结果Tab.5 Analysis results of association rules of drugs for treatment of diabetes mellitus

2.7 高频中药聚类分析 对使用频次排名前25的中药进行聚类分析，得到8个药物聚合组，第1组：黄芪、葛根、丹参；第2组：地黄、麦冬、天花粉；第3组：茯苓、泽泻、山药、山茱萸；第4组：人参、黄精、玉竹、地骨皮；第5组：白术、当归、甘草、桑叶；第6组：枸杞子、玄参、苍术；第7组：知母、五味子；第8组：石斛、黄连。统计结果见表6、图5。

图5 治疗糖尿病高频药物聚类图Fig.5 Cluster of high-frequency drugs in the treatment of diabetes mellitus

表6 治疗糖尿病高频药物聚类统计表Tab.6 Cluster statistics of high-frequency drugs in the treatment of diabetes mellitus

2.8 成分靶点网络的构建 依据药代动力学参数，设置DL≥0.18，OB≥30，共检索得到黄芪、葛根、丹参有效成分89个，其对应靶点1 346个，糖尿病疾病靶点420个，药物靶点与糖尿病疾病靶点取交集共得到共有靶点57个，通过Cytoscape 3.7.1软件构建“药物-成分-靶点-疾病网络图”，见图6。

图6 药物-成分-靶点-疾病网络图Fig.6 Drug-ingredient-target-disease network diagram

2.9 PPI网络分析和核心靶点筛选 为进一步探讨靶点在蛋白水平的作用关系，将STRING数据库分析结果导入 Cytoscape 3.7.1软件并通过 Network Analyzer插件进行拓扑分析，以>2倍DC中位数27为筛选条件，筛选中心靶点28个，再次以≥BC中位数14.87为条件，得到该方剂治疗糖尿病的最相关靶点 14 个，分别是 TNF，AKT1，IL1B，IL6，STAT3，PPARG，MMP9，TP53，CXCL8，CCL2，PTGS2，NOS3，PPARA，ESR1，见图 7。

图7 PPI网络图Fig.7 PPI network diagram

2.10 GO和KEGG通路富集结果与分析 利用R语言对该方剂治疗糖尿病的57个潜在靶点进行GO功能注释，并按P值进行排序（阈值为P＜0.05），将排名前20的潜在生物过程（BP）进行展示，同时，将潜在靶点进行KEGG功能分析，并将排名前20通路进行展示，见图8。

图8 GO和KEGG通路富集结果Fig.8ResultsofGO和KEGGpathway

2.11 分子对接结果分析 选取关键靶点AKT1、IL-6、TNF与相应关键活性成分作分子对接，构建分子对接互作模式图，结果显示相关靶点与活性成分可自发结合，形成稳定构象，具有良好结合活性，见图9。

图9 分子对接结果Fig.9 Molecular docking results

3 讨论

中医将糖尿病归为“消渴病”范畴，其病机主要为阴津亏损，燥热偏盛，病理性质以阴虚为本、燥热为标，根据三消辨证法，将其分为“上消”“中消”“下消”，分以白虎加人参汤、葛根芩连汤、金匮肾气丸进行论治[11-12]。

本次数据挖掘结果显示黄芪、地黄、山药、葛根、麦冬等使用频率较高，四气五味分别以平性、寒性药物占比最大（46.52%），甘味、苦味占比最大（64.09%），分析可知临床治疗糖尿病仍以能和能缓，能燥能坚的清热益气、泻火存阴功效药物为主[13]。另外关联规则显示黄芪-地黄，黄芪-山药，黄芪-葛根，地黄-麦冬，黄芪-麦冬，置信度较高，是治疗糖尿病较为常见的药物组合，其功效亦主要以清热生津，益气养阴为主。

根据聚类分析所得的新的高频中药方剂组方由黄芪、葛根、丹参组成，其中黄芪补中益气固表，葛根清热生津止渴，丹参活血祛瘀通络，三者相合共奏益气养阴，养血通络之功。通过成分靶点网络的构建，发现该方剂的药物靶点与糖尿病疾病靶点共57个，且该可能通过Przewalskin B、isoflavanone、（2R）-3-（3，4-二羟基苯基）-2-[（Z）-3-（3，4-二羟基苯基）丙烯酰基]氧基丙酸、（Z）-3-[2-[（E）-2-（3，4-二羟基苯基）乙烯基]-3，4-二羟基-苯基]丙烯酸 、（6S）-6-hydroxy-1-methyl-6-methylol-8，9-dihydro-7H-naphtho[8，7-g]benzofuran-10，11-quinone、丹参醌新酮Ⅱ等有效成分发挥治疗作用。PPI网络分析和核心靶点筛选结果显示，TNF，AKT1，IL1B等可能为该方剂治疗糖尿病的关键因子，GO功能显示，该方剂对糖尿病的防治主要涉及基因表达的正向调控，一氧化氮生物合成过程的正调控，炎症反应，平滑肌细胞增殖的正调节，血管生成的正向调节，转录的正调控等方面，KEGG富集通路显示，流体剪切应力和动脉粥样硬化，AGERAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用，脂质和动脉粥样硬化，癌症的途径，TNF信号通路等可能为重要通路，其中TNF信号通路在核心靶点、功能富集及通路富集中均有显示，可能为该方剂防治糖尿病的关键通路。

本研究应用数据挖掘联合网络药理学的方法对专利网治疗糖尿病的中药处方的用药规律作统计分析，并通过分子对接实现虚拟验证，初步揭示该药组防治糖尿病的作用机制，后期将通过该组方配制的中药代茶饮进行临床研究，完成该药组对防治糖尿病的疗效评价，并结合药物分析、分子生物学验证等实验研究方法探究该药组的药效物质基础，为中药复方防治糖尿病的临床应用提供依据，也为揭示中医药防治糖尿病科学内涵的相关研究提供思路。