MiR-129-5p 在肺腺癌中的表达及其临床意义

张建海 王巍 王前 许佳伦 高娜

肺癌是国内第一大癌症疾病，死亡率也位居所有癌症之首，5 年以上存活率仅18%［1］。由于肺癌患者早期症状普遍不明显，实验室指标也不具特异性，导致肺癌临床诊断存在一定困难，目前临床对于肺癌的诊断主要通过影像学及病理学检查，其中以病理活检诊断准确率最高，是诊断肺癌及其分型的金标准，但该诊断方式具有有创性，临床应用存在一定的局限性［2］。环状RNA（circular-RNA，circRNA）是近年来发现的一种新型竞争性内源性RNA（ceRNAs），其在生物体内含量较为丰富，主要由mRNA 前体（pre-mRNA）经反向剪接环化而形成，具有稳定性、保守性、普遍性、组织和疾病特异性的特点，有望成为一种癌症诊断及预后的生物学标志物［3］。近年来，相关文献报道了circRNA 应用于胃癌、乳腺癌及神经胶质瘤等多种癌症诊断及患者预后评估方面的价值［4-5］。本实验对肺腺癌患者组织中差异性表达的环状RNA 进行筛选及验证，以初步探讨MiR-129-5p 作为肺腺癌早期诊断分子生物标志物的价值。

1 对象与方法

1.1 临床标本

收集2014 年1 月至2017 年1 月年度北京市大兴区中西医结合医院的50 例肺腺癌病人的外周血液样本10 mL（肺腺癌组），同时选取门诊体检的健康志愿者30 名（健康对照组），抽取外周血液10 mL。肺腺癌患者，纳入标准：术中、医院病理学检查确诊为浸润性腺癌，排除标准：①病理学诊断为非腺癌或混合型癌，依据第八版肿瘤TNM 分期标准进行肿瘤分期；②在采血之前，接受过任何手术、化疗、放疗；③合并肺结核、高血压、冠心病等基础疾病；④病历资料不完全。患者均签署知情同意书，本研究通过了北京市大兴区中西医结合医院的伦理委员会批准。

1.2 样品收集

抽取患者10 毫升血液并放置于三个试管中；其中一个含有用于全血细胞计数（Whole blood cell count，WBC）的 乙 二 胺 四 乙 酸（Ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA），第二个含有用于凝血酶原时间（prothrombin time，PT）测量的柠檬酸钠，第三个离心管用于血清分离。血清用于测定所有血清学测试，包括ELISA 和分子生物学技术。

1.3 RNA 提取

使用Qiagen（Valenica，CA）试剂盒从血清中提取RNA。RNA 浓度由NanoDrop2000（ThermoScientific）测定。

1.4 逆转录反应

使用Qiagen 通过RT-PCR 试剂盒将RNA 逆转录为cDNA。使用miScriptSYBRGreenPCRKit（Qiagen）试剂盒通过实时RT-PCR 扩增cDNA 模板。使用转子基因QSystem（Qiagen）进行定量PCR（qPCR）。而MiR-129-5p 的基因表达被标准化 为SNORD68 表 达。通 过2-δδCt 方 法 计 算RNA 的相对表达。MiR-129-5p 的引物由德国Qiagene 公司提供。用于扩增NEAT1 基因表达的引物是（776716R5485）：正向50-TGGCTAGCTCAGGGCTTCAG-30 和反向50-TGAAAACCTTTACCCCAGGA-30（Invitrogen）。

1.5 定量实时PCR（qRT-PCR）

使用TRIzol 试剂从培养的细胞中提取总RNA。 使 用 总 RNA 用 cDNA 合 成 试 剂 盒（FastQuantRT 试剂盒，中国北京天根）合成cDNA。根据制造商的建议，使用SuperRealPreMixPlus（天根）进行qRT-PCR。用于qRT-PCR 的所有引物的序列列于补充表1。所有实验均以三份形式进行。β-actin 和U6 表达分别用于mRNA 和MiR-129-5p 表达的正常化。使用2-ΔΔCt 方法确定了相对表达水平。

1.6 随访

术后追踪病人全部经门诊或电话追踪，直至2022 年1 月份，并进行5 年的整体生存统计。

1.7 统计分析

2 结果

2.1 两组MiR-129-5p 表达水平比较

肺腺癌组MiR-129-5p（0.92±0.06）的表达水平低于对照组（0.18±0.07），比较差异有统计学意义（t=48.215，P＜0.001）。见图1。

2.2 MiR-129-5p 表达与肺腺癌患者临床病理特征的关系

MiR-129-5p 表达与肺腺癌分化程度、淋巴结转移、远处转移、年龄（＞60 岁与＜60 岁）、TNM 分期、浸润深度、表皮生长因子受体（Epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）基因突变有关（P均＜0.05），与患者性别、吸烟与否、肿瘤大小无关（P＞0.05）。见表1。

表1 MiR-5129-55p 表达与肺腺癌患者临床病理特征的关系Table 1 Relationship between MiR-5129-55p expression and clinicopathological features of patients with lung adenocarcinoma

2.3 生存分析显示

以肺腺癌血清中MiR-129-5p 表达的中位数为基准，将肺腺癌分为高、低表达组。MiR-129-5p 高表达组5 年总生存率高于MiR-129-5p 低表达组（P＜0.05）。Cox 回归分析发现，肺腺癌分化程度、淋巴结转移、远处转移、TNM 分期、浸润深度和MiR-129-5p 表达是肺腺癌患者预后的独立风险因素。见图2、表2。

图2 MiR-129-5p高低表达肺腺癌患者5年生存率K-M 分析Figure 2 K-M analysis of 5-year survival rate of patients with high and low expression of MiR-129-5p in lung adenocarcinoma

表2 肺腺癌患者预后的风险因素分析Table 2 Analysis of prognostic risk factors in patients with lung adenocarcinoma

图2 MiR-129-5p 相关的ROC 曲线Figure 2 The ROC curve of MiR-129-5p

2.4 MiR-129-5p 对肺腺癌的诊断效率

通过绘制ROC 曲线（n=80），包括肺腺癌组=50 例，健康对照组=30 例，MiR-129-5p 诊断肺腺癌的敏感性为65.6%，特异性为75.0%，AUC=0.751，P=0.002，临 界 值0.452，95%CI为0.613～0.887。

3 讨论

肺腺癌是原发性肺癌较为常见的一种亚型，其属于腺上皮恶性肿瘤，具有众多的组织学分类，可以以腺泡、细支气管肺泡、乳头等形式存在。有研究报道，肿瘤标志物的水平高低可以预测瘤体的大小和TNM 分期［6］。此外，首次诊断或治疗前升高的标志物水平也可以用于监测后续的治疗效果和预后判断。

随着基因组测序技术的快速发展，近年来越来越多不具备蛋白质编码功能的RNA 被发现。MiRNA 是一类长19～25 个核苷酸的内源性非编码小RNA，多位于肿瘤相关的脆性位点或基因区域，其能够与具备蛋白质编码功能的信使RNA 结合广泛参与肿瘤病理生理过程［7-8］。MiR-129-5p 由MiR-129-1 和MiR-129-2 协同转录而成，近年来，有研究报道［9］显示，MiR-129-5p 可在多种恶性肿瘤中发挥重要作用。在胃癌中，miR-129-5p 可通过靶向白细胞介素-8 参与胃癌细胞的迁移和入侵。在乳腺癌中，miR-129-5p 通过靶向HMGB1 来减弱辐照诱导自噬，并降低乳腺癌细胞的辐射抵抗力；miR-129-5p 是肿瘤生长的抑制剂。但在喉癌组织中MiR-129-5p 表达则显著上调，其主要是通过靶向作用于含WW 结构域的E3 泛素蛋白连接酶1 而促进癌细胞增殖和浸润。MiR-129-5p 在肺癌组织中表达显著下调，其主要通过靶向抑制肺癌组织中血管内皮生长因子的生成而发挥对癌细胞迁移和侵袭能力的抑制作用。MiR-129-5p 在肝癌组织中表达下调，上调其表达可提升其对钙调蛋白依赖性蛋白激酶4 的调节作用，进而进一步起到对癌细胞增殖、迁移、浸润的抑制作用［10-11］。本研究结果提示，MiR-129-5p 在肺腺癌细胞中表达显著下调，明显低于健康对照组患者，由此推测，MiR-129-5p 与肺腺癌疾病发生、进展、预后可能存在某种关系，可通过调控下游靶基因，从而发挥促癌或抑癌的作用，具有成为诊断肺腺癌的生物标志物潜力。

进一步验证其在肺腺癌血液中表达水平与临床病理特征的相关性及对肺腺癌诊断效率分析。研究发现，扩大样本量进行qRT-PCR 发现，MiR-129-5p 表达水平与肺腺癌分化程度、淋巴结转移、远处转移、年龄、TNM 分期、浸润深度、EGFR 基因突变有关，但在患者性别、吸烟与否、肿瘤大小未见显著性差异。它与分化程度呈负相关，分化程度越高，表达水平就越低，这表明miR-129-5p在肺腺癌的发生和进展中起着重要作用。此外，它与TNM 分期、浸润深度、EGFR 基因突变呈负相关；表达水平越低，疾病的严重程度就越高，这表明miR-129-5p 可用于判断疾病的严重程度。

胡俊华等［12］发现MiR-129-5p 可能成为结肠癌新的治疗靶点。MiR-129-5p 表达可能会对肿瘤化疗敏感性产生影响。Lu 等［13］发现，MiR-129-5p 通过下调RpS6，使Her-2 阳性乳腺癌对曲妥珠单抗过敏。Ma 等［14］研究报告称，MiR-129-5p 通过直接靶向DLK1 来抑制NSCLC 和化疗耐药性。Zeng等［15］发现，microRNA-129-5p 通过靶向SOX2 抑制乳腺癌中的阿霉素耐药性。基于上述研究，我们可以确认MiR-129-5p 可能成为肺腺癌预后的潜在生物标志物，但MiR-129-5p 在肺腺癌中的作用机制仍不清楚。本研究发现MiR-129-5p 低表达患者的5 年存活率明显下降，预后不佳。此外ROC 曲线提示MiR-129-5p 对肺腺癌的诊断准确度高，这表明MiR-129-5p 相对表达水平对评估肺腺癌诊断、预后和癌症治疗疗效具有重要价值。

本研究从表达水平、与临床病理特征、预后关系等多方面研究了miR-129-5p 在肺腺癌患者血液中的表达水平，为临床研究提供了参考。但研仍存在一些局限性，仅侧重于血清学以探索其价值，过于单一。且由于肺腺癌5 年以上存活率低，随访时间短，加上治疗差异，miR-129-5p 与肺腺癌患者长期生存预后之间的关旭仍需进一步研究。总之，肺腺癌组织中MiR-129-5p 低表达，其表达变化与肺腺癌发生发展及预后有关；血清MiR-129-5p 可用作肺腺癌癌症诊断和预后的潜在生物标志物。