草莓茎尖组培快繁体系的建立

韩如春，常 婧，赵 静，侯雷平，李梅兰

（1.山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801；2.小店区农业农村局乡村振兴发展中心，山西 太原 030032）

草莓（Friagaria×ananassaDuch.）为蔷薇科草莓属的多年生草本植物[1]，属水果性蔬菜，被称为“水果皇后”，具有较高的栽培价值[2]。其原产南美，后被世界各地广泛引种，主要分布于亚洲、南美洲、欧洲等地[3-4]。现代医学证明，草莓具有抗衰老作用，对白血病、肠胃病、障碍性贫血以及动脉粥样硬化、高血压、冠心病等疾病具有一定的预防和治疗作用[5-8]，同时因其管理容易、适应性强等优点，在我国已经大面积栽培[9]。依据区域位置和自然条件等情况，我国草莓产地主要可以划分为三大主产区，分别是北方产区、中部产区和南方产区[10]。其中，位于北方产区的山西省草莓种植面积和产量逐年增大，全省各地均建有草莓种植示范基地，在促进各地农业高效增收中发挥着极其重要的作用。

草莓的种苗生产主要采用匍匐茎繁殖，容易导致病毒病的发生，从而使得种苗不断退化，出现植株低矮、果畸形、结果少等现象，严重影响草莓的产量和品质[11-13]。已有研究表明，通过茎尖组织培养培育脱毒草莓种苗是防治病毒病的根本对策[14-15]，该方法繁殖速度越快，脱毒效果越好，能满足规模化生产需求[16]，使草莓品种和优良特性得以保持，可以有效提高种苗品质[17-18]。因此，为获得优质高产的草莓，对建立其组培快繁体系的需求也越来越大，虽然有关这方面的研究尚多，但关于筛选2 个不同草莓品种的最佳快繁条件的报道相对较少，有待于进一步完善。

本试验选取红颜和隋珠2 个品种的匍匐茎茎尖作为外植体，通过研究茎尖诱导分化培养、继代培养、生根培养和移栽驯化过程，确定2 个草莓品种最适宜的激素配比和培养基类型，旨在建立草莓脱毒快繁体系，为今后的生产研究提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料及试剂

供试材料选用山西省主栽品种红颜和目前市场上正在兴起的新品种隋珠，取样部位为匍匐茎茎尖。

试剂MS（M519）、Agar（A111）均购 自Phyto Technology Laboratories 公司；蔗糖（分析纯）购自天津凯通化学试剂有限公司；6-BA 和NAA 均购自上海生物工程有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 外植体的获得和消毒方法筛选 于晴天上午摘取小叶尚未展开的匍匐茎，剪下后迅速插入装有清水的瓶中；于实验室内，摘掉外部多余的叶片，截取2～3 cm 匍匐茎茎尖，自来水下流动冲洗2 h，用于外植体的消毒。于超净工作台上紫外消毒与通风各进行20 min后，将处理好的外植体用75%酒精消毒30 s，蒸馏水清洗5次[19]，再用0.1%升汞分别浸泡2、4、6、8、10、12 min，蒸馏水清洗8次。将完成消毒的外植体用已高温灭菌的小刀、镊子剥除小叶，切取0.5 mm 左右茎尖[20]，分别接种于初代培养基上。每处理接种3瓶，每瓶5个外植体，10 d后统计成活率和污染率，选出最佳的消毒方法。

1.2.2 初代培养基筛选 初代培养基中的6-BA设置5个质量浓度梯度：0、0.1、0.3、0.5、1.0 mg/L；NAA设置3 个质量浓度梯度：0、0.1、0.2 mg/L，自由组合后共15个处理，每个处理3瓶，每瓶接种5个茎尖，重复3 次。初代培养15 d 后统计成活率，30 d 后统计诱芽率，以选出最佳的分化培养基。

1.2.3 继代培养基筛选 筛选到最佳初代培养基后，以2～3苗为一丛，进行转瓶增殖。6-BA设置2个浓度梯度：0.3、0.5 mg/L，NAA 设置3 个质量浓度梯度：0、0.1、0.2 mg/L，共6 个组合，每个组合3 瓶，每瓶接种3个芽丛，重复3次。30 d后统计增殖系数，以选出最佳的增殖培养基。

增殖系数＝增殖芽数量/草莓组培苗不定芽数 （4）

1.2.4 生根培养基筛选 增殖继代培养30 d后，选取长势较为健壮并且长至3～4 cm的芽进行生根培养。以1/2 MS为基础培养基，NAA设置3个质量浓度梯度，分别是0.1、0.3、0.5 mg/L，同时MS 和1/2 MS单独设置2个处理，组合后得到5个处理，每瓶接种2 株草莓小苗，重复3 次。20 d 后统计生根率和生根状况。

生根率＝生根数/草莓组培苗接种数×100% （5）

1.2.5 基本培养基及培养条件 MS为诱导和增殖的基本培养基，1/2 MS 为生根时的基本培养基，各个培养基均添加30 g/L 蔗糖和7.5 g/L 琼脂。在添加完MS或1/2 MS和蔗糖之后，先将pH值调至5.8，再加琼脂，溶解煮到清透后，分别添加植物激素生长调节剂6-BA 和NAA，最后121 ℃高温高压蒸汽灭菌20 min，后冷却凝固备用。培养温度24 ℃，光照强度2 600 lx，各培养阶段光照时数设定为14 h/d。

1.2.6 移栽驯化 一般通过继代增殖后的无根苗转接至生根培养基培养30 d左右即有10多条根系发出，此时即可进行驯化移栽。将已达到驯化移栽条件的组培苗移至温室，在自然光条件下炼苗7 d 左右，即前2 d先采用闭盖炼苗方式、中间松盖炼苗2 d、最后3 d 开盖炼苗，使组培苗逐渐适应外界环境。炼苗完成后取出组培苗，在水龙头下流水冲洗掉多余的培养基，再用1 000倍多菌灵浸根消毒后，移栽入已消毒的灭菌基质（泥炭∶蛭石∶珍珠岩＝3∶1∶1）中，此时控制温室内温度23～27 ℃，空气相对湿度40%左右[21]，每天10：00—15：00需进行适当遮阴，避免日光暴晒，当缓苗完成后进行成活率统计调查。

1.3 数据分析

采用SPSS 23.0 对试验数据进行差异显著性分析（α＝0.05）；采用Excel 2003软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对草莓茎尖分化的影响

结果表明（表1），升汞处理时间长短与草莓茎尖的成活率和污染率存在一定关系。消毒时间越短，污染率越高，当升汞处理时间为2 min 时，红颜和隋珠草莓茎尖污染率最高，分别为33.33%和73.33%；随着升汞处理时间的增加，茎尖污染率逐渐呈现降低趋势，成活率呈现先升高后降低趋势，且均在处理8 min 时成活率最高，说明短时间处理未能消毒完全，长时间处理使茎尖失活。此外，在最优消毒处理下，红颜的成活率（86.70%）高于隋珠（60.00%）。

表1 不同消毒时间处理对红颜和隋珠品种的影响Tab.1 The effect of different disinfect time on Hongyan and Suizhu

2.2 不同激素组合对草莓茎尖萌发诱导的影响

从表2 可以看出，2 个草莓品种的茎尖不添加任何激素也可诱导出芽苗，但成活率和诱芽率偏低；仅添加NAA 时，随着质量浓度的增加，诱导出的愈伤组织越来越多，而且诱芽率也不高；仅添加6-BA 时，长势优于仅添加NAA，诱芽率也较高，但是随着其质量浓度的增加，植株褐化加重，诱芽率也会降低。

表2 不同激素组合对红颜和隋珠茎尖萌发诱导的影响Tab.2 Effects of different hormone combinations on shoot tip germination and induction of Hongyan and Suizhu

比较2个种激素的组合，对于红颜品种来说，以处理10即MS＋6-BA 0.3 mg/L＋NAA 0.1 mg/L的培养基中成活率最高，诱导出芽苗多，长势也较好；而对于隋珠品种，诱导成苗效果最好的培养基激素组合是处理12，即MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，成活率达93.33%，诱芽率达68.23%，且长势旺盛，叶色翠绿。2个品种的NAA质量浓度均为0.1 mg/L，但是隋珠品种要求的6-BA质量浓度略高于红颜品种。总而言之，激素质量浓度过低或过高都不利于茎尖的萌发，适宜的激素配比才可促进红颜和隋珠外植体的正常萌发发育。

2.3 不同激素组合对草莓不定芽增殖的影响

经过初代培养基的诱导培养，筛选到激素质量浓度为6-BA 0.3～0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L时，2个草莓品种的茎尖成活率较高，所以，继代培养基以上述激素配比为组合继续筛选。由表3可知，红颜由单独苗增殖至芽丛时间需要20～40 d，而隋珠则需30～50 d。

表3 不同激素组合对隋珠和红颜不定芽增殖的影响Tab.3 Effect of different hormone combination on adventitious bud proliferation in Hongyan and Suizhu

比较各个激素的配方，红颜草莓最适宜的增殖培养基是5号培养基，即MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，增殖系数达到5.20；且相同NAA质量浓度下，6-BA 0.5 mg/L 处理的增殖系数高于0.3 mg/L。针对隋珠品种，其最佳增殖培养基为MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，增殖系数为4.21；且6-BA 0.5 mg/L 处理的增殖系数均高于0.3 mg/L 处理，诱导丛芽时间也缩短，从40～50 d 缩短为30～40 d。综合来看，红颜草莓茎尖分化能力优于隋珠，增殖效果良好，诱导出丛芽的时间也较短，6-BA质量浓度一定时，高质量浓度的NAA 更有利于腋芽的增殖，增殖系数也随之提高，但6-BA质量浓度不宜太高，过高会影响草莓腋芽分化增殖。

2.4 不同激素组合对2种草莓生根培养的影响

将分成单株且长至3～4 cm的草莓小芽进行生根培养。由表4可知，采用以1/2 MS为基本培养基的2个草莓品种的生根率显著高于以MS为基本培养基的处理1，说明1/2 MS 比MS 更有利于组培苗生根。对于红颜品种，当基本培养基为1/2 MS、不添加NAA 时，生根率高达100%，平均根数达18 条左右，且生根效果最好；随着NAA 浓度的不断升高，根基部出现的愈伤组织逐渐增多，生根率有所下降，且影响根系生长。而对于隋珠品种，当NAA质量浓度为0.1 mg/L 时，生根率最高为100%，生根条数最多，平均根长也达到最长；当NAA质量浓度上升为0.3、0.5 mg/L 时，生根率也达到100%，但是根长缩短，愈伤增多，苗黄化，叶卷曲。

表4 不同激素组合对红颜和隋珠品种生根的影响Tab.4 The effect of different combinations on rooting of Hongyan and Suizhu

综合来看，1/2 MS显著优于MS培养基，1/2 MS和NAA 都能提高生根率和生根数，其中隋珠品种生根率高，但生根数少，根条短小，与红颜品种有所差别。

2.5 移栽驯化

2 个草莓品种的组培苗生根培养30 d 左右，叶片舒展呈深绿色且出现表皮毛后，即已达到移栽驯化的条件。自然光照条件下闭盖、半松盖、开盖驯化7 d 后，将其基部培养基洗去，后用1 000 倍多菌灵浸根消毒，然后栽入泥炭∶蛭石∶珍珠岩配比为3∶1∶1的混合基质中，使其健康生长，红颜和隋珠品种的移栽成活率均高达100%（图1）。

3 结论与讨论

在草莓组培快繁试验中，消毒剂所带来的消毒效果对草莓组织培养是否成功有着很大影响。相同浓度的升汞处理时间不同，对茎尖的消毒效果也明显不同，当不处理或者处理时间过短时，外植体的污染率最大接近100%；但是当升汞处理时间逐渐增加，其成活率逐渐降低，这可能是由升汞对外植体本身活力造成了不可逆转的伤害而引起的。由此可见，当选用0.1%升汞处理茎尖时，适宜的处理时间是关键。本试验结果表明，乙醇加上0.1%升汞处理8 min 是草莓茎尖消毒的最佳方式，与郭靖[22]的研究结果一致。

植物激素和植物生长调节剂的种类、含量对外植体茎尖萌发影响很大，配比适中可促进茎尖细胞分化能力和细胞的形态建成。6-BA属于细胞分裂素类，可以很好地促进细胞分裂，诱导植株形成新芽并诱导愈伤组织的产生；而NAA 能促进细胞的分裂与扩大，诱导形成不定根。曹善东[23]经研究筛选出2 种组培快繁脱毒草莓苗的培养基配方为MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.02 mg/L 和MS＋6-BA 1.0 mg/L＋IAA 1.0 mg/L，发现6-BA 质量浓度大于1.0 mg/L时，茎尖成活率下降，高质量浓度抑制不定芽形成；6-BA质量浓度一定时，高质量浓度的NAA更有利于腋芽的增殖，增殖系数也随之提高。本研究中，仅添加6-BA 情况下，茎尖也可以萌发，但诱芽率低，当6-BA质量浓度为0.3 mg/L时，红颜品种的诱芽率较高，而隋珠品种则是在6-BA 质量浓度为0.5 mg/L 时诱芽率最高；仅添加生长素时诱芽率也较低，说明在芽的分化过程中，不单单取决于单一激素的质量浓度，而且取决于激素之间的比例，不同品种对植物生长调节剂的需求稍有差异。在芽的增殖过程中，随着外源激素质量浓度的不断升高，2 个草莓品种的诱导分化和增殖能力也明显提高，但是当达到一定的激素配比时，草莓组培苗发黄发褐，长势不好，这与张玲等[24]的研究结果类似，在他们的试验中，章姬草莓最佳的增殖培养基是MS＋6-BA 0.5 mg/L＋IBA 0.10 mg/L。本研究比较2个品种，隋珠的增殖效果相比红颜较差，同时诱导出丛生芽的时间也较长，说明基因型会影响芽体的增殖。颜昌敬[25]研究发现，草莓试管苗比较容易生根，在无植物生长调节剂的培养基上就能长出大量根系，添加NAA 0.1 mg/L后发根量反而减少。张建盈等[26]研究发现，不添加IBA 的1/2 MS是白雪公主草莓最适宜的生根培养基，生根率达100%，平均生根数为10条，平均根长为5.00 cm。本研究中，隋珠品种的生根率在有激素时较高，而红颜品种没有激素时生根率就可以达到100%，而且平均生根数是隋珠的3倍左右，表明不同草莓品种生根所需要的植物生长调节剂类型有所不同，同时适宜的激素配比有利于组培苗的生根。

2 个草莓品种的茎尖诱导成活率、腋芽增殖分化能力和生根能力都有所区别，这可能是由于不同的品种会对不同培养基的激素配比存在不同的敏感程度，外部条件如生长环境和植株本身种性等原因都会造成它们的茎尖萌发能力、腋芽增殖能力及生根率等都有所不同。在本试验草莓组培的过程中，出现了褐化和玻璃化等问题，仍需要进行更深一步的相关研究。

本研究结果表明，草莓红颜和隋珠品种0.1%HgCI2灭菌的最佳时间均为8 min，成活率分别达86.70%和60.00%。最适宜的茎尖诱导培养基红颜品种是MS＋6-BA 0.3 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，而隋珠品种为MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，诱芽率分别为68.00%和68.23%。最适宜的继代增殖培养基红颜品种是MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，隋珠品种为MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，增殖系数分别达5.20 和4.21。红颜品种最适宜的生根培养基是1/2 MS，而隋珠品种需在1/2 MS基本培养基基础上加入NAA 0.1 mg/L，生根率均达到100%。无菌苗移栽于泥炭∶蛭石∶珍珠岩为3∶1∶1的混合基质中，均可成活，且长势良好。