波形蛋白、骨桥蛋白在三阴性乳腺癌>组织中的表达情况及其与预后的关系▲

郭彬彬 郭 满 张子杰 张 浩

(河南省南阳市中心医院1 乳腺外科，2 甲状腺外科，3 病理科，南阳市 473000，电子邮箱：2550767113@qq.com)

乳腺癌是发展中国家女性发病率最高的癌症，也是女性癌症相关死亡的主要原因[1],其发病率逐年增长且发病人群趋于年轻化[2]。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)约占所有乳腺癌的10.0%～17.0%。与非三阴性乳腺癌相比，TNBC的发病人群更趋于年轻化[3]，且更具侵袭性，易发生内脏转移，因雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体-2的表达缺失，对内分泌治疗及特异性靶向治疗不敏感[4]，预后较差。波形蛋白是一种重要的细胞骨架蛋白，是中间纤维蛋白家族中最重要的一员[5]，与肿瘤的增殖、侵袭、转移及预后相关[6]。骨桥蛋白是一种多功能分泌型磷酸糖蛋白，在转移癌和具有高转移潜能的肿瘤中呈高表达[7-8]。截至目前，国内外对波形蛋白、骨桥蛋白的共同研究较少，两者在TNBC的发生和发展中的作用机制尚不清楚。本研究检测波形蛋白、骨桥蛋白在TNBC中的表达情况，分析两者与TNBC临床病理特征及预后的相关性，探讨两者在TNBC复发、转移中作用的可能机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年1月至2015年12月南阳市中心医院收治的120例TNBC患者为研究对象(TNBC组)。纳入标准：均经病理确诊为TNBC，既往未接受过抗肿瘤治疗。排除标准：双侧乳癌，合并脏器功能障碍，炎性乳腺癌，其他部位恶性肿瘤，生存资料不完善的病例。120例TNBC患者年龄 28～76(51.86±9.07)岁；肿瘤直径：T0～T1期 49 例，T2期 70例，T3期1例；存在淋巴结转移48例，无淋巴结转移72例；原发肿瘤-区域淋巴结-远处转移分期：Ⅰ期31 例，Ⅱ期65例，Ⅲ期24例。另选取同期收治的30例乳腺良性疾病患者作为对照组。纳入标准：术后经病理确诊为乳腺良性疾病，包括乳腺纤维腺瘤及乳腺增生症。排除标准：合并乳腺癌或其他部位恶性肿瘤。30例乳腺良性疾病患者年龄 30～67(48.70±9.50)岁，其中乳腺增生症11例，乳腺纤维腺瘤19例。两组年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经南阳市中心医院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 免疫组化法检测波形蛋白、骨桥蛋白的表达情况 采用免疫组化法检测波形蛋白、骨桥蛋白在TNBC肿瘤组织及乳腺良性疾病组织中的表达情况。将石蜡包埋的TNBC组织及乳腺良性疾病组织连续切成3 μm切片，将切片放入60℃恒温箱中烘烤2 h，然后使用二甲苯浸泡15 min，更换新鲜二甲苯后再浸泡15 min，递减梯度乙醇(无水乙醇、体积分数95%乙醇、体积分数75%乙醇、三蒸水)脱去二甲苯并水化，枸橼酸钠缓冲液(pH=6.0)高压抗原修复，滴加体积分数为3%的过氧化氢溶液室温孵育20 min；磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline，PBS)冲洗，滴加即用型一抗(兔抗人骨桥蛋白单克隆抗体工作液100 μL、兔抗人波形蛋白多克隆抗体工作液100 μL)，置于湿盒中室温孵育2 h，PBS冲洗3次，3 s/次，室温下滴加二抗(酶标羊抗鼠/兔聚合物)，二氨基联苯胺显色，蒸馏水冲洗3次，3 s/次，苏木精复染，蒸馏水冲洗返蓝，递减梯度乙醇(无水乙醇、体积分数95%乙醇、体积分数75%乙醇、三蒸水)脱水、二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察着色情况。以PBS代替一抗进行上述步骤作为TNBC组与对照组的阴性对照。

1.3 结果判定 以胞质中出现棕色或棕黄色颗粒为阳性细胞。按半定量积分法判断波形蛋白、骨桥蛋白表达情况，根据染色强度及阳性细胞所占比例计分：无着色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；阳性细胞所占比例<15%计0分，阳性细胞所占比例为15%～25%计1分，阳性细胞所占比例为 26%～50%计2分，阳性细胞所占比例为51%～75%计3分，阳性细胞所占比例>75%计4分。将染色强度和阳性细胞所占比例评分相加，总分<4分为阴性表达，≥4分为阳性表达。

1.4 随访方法 随访方式采用电话随访和门诊复诊，随访截至2019年3月，或患者出现复发、转移及死亡则随访终止，平均随访时间55个月，无失访病例。

1.5 统计学分析 采用 SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用 Spearman秩相关分析；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线；生存情况的比较采用log-rank检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TNBC组患者与对照组患者波形蛋白、骨桥蛋白表达情况的比较 镜下观察可见波形蛋白在TNBC组织中大量表达，而在乳腺良性疾病组织中少量表达，见图1。TNBC组波形蛋白的阳性表达率为25.00%(30/120)，高于对照组的阳性表达率6.67%(2/30)(χ2=4.807，P=0.028)。镜下观察可见骨桥蛋白在TNBC组织中大量表达，而在乳腺良性疾病组织中少量表达，见图2。TNBC组骨桥蛋白的阳性表达率为26.67%(32/120)，高于对照组的阳性表达率3.33%(1/30)(χ2=7.615，P=0.006)。

图1 波形蛋白的表达情况(免疫组化，×200)

图2 骨桥蛋白的表达情况(免疫组化，×200)

(A：TNBC组；B：对照组)

2.2 波形蛋白、骨桥蛋白表达阳性和表达阴性的TNBC患者临床病理特征的比较 波形蛋白阳性表达患者肿瘤直径为T2或T3期，淋巴结转移为N2或N3，临床分期为Ⅲ期的比例均高于波形蛋白阴性表达患者(均P<0.05)；不同年龄、绝经状态在波形蛋白阳性表达患者与阴性表达患者之间的分布差异均无统计学意义(均P>0.05)。骨桥蛋白阳性表达患者肿瘤直径为T2期，临床分期为Ⅱ期或Ⅲ期的比例均高于骨桥蛋白阴性表达患者(均P<0.05)；不同年龄、淋巴结转移情况、绝经状态在骨桥蛋白阳性表达患者与阴性表达患者之间的分布差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 波形蛋白、骨桥蛋白表达阳性和表达阴性的TNBC患者临床病理特征的比较[n(%)]

2.3 TNBC患者波形蛋白、骨桥蛋白表达情况的相关性分析 Spearman秩相关分析结果显示，TNBC患者波形蛋白与骨桥蛋白的表达情况呈正相关性(rs=0.392，P<0.001)。

2.4 TNBC患者波形蛋白、骨桥蛋白表达情况与预后的关系 120例TNBC患者随访11～74个月，中位随访时间为62.8个月，复发、转移10例，死亡25例。截至随访终止时间，波形蛋白阳性表达TNBC患者的无病生存率为 40.0%，低于波形蛋白阴性表达TNBC患者的81.1%(χ2=18.407，P<0.001)，见图3。骨桥蛋白阳性表达TNBC患者的无病生存率为 59.4%，低于骨桥蛋白阴性表达TNBC患者的 75.0%(χ2=4.492，P=0.042)，见图4。

图3 波形蛋白阳性表达TNBC患者和波形蛋白阴性表达TNBC患者的生存曲线

图4 骨桥蛋白阳性表达TNBC患者和骨桥蛋白阴性表达TNBC患者的生存曲线

3 讨 论

乳腺癌已经跃居女性恶性肿瘤发病率第一位[9]。相比较于其他类型乳腺癌，TNBC的组织学分级和侵袭性更高，TNBC内脏转移的发生率多于骨转移，易发生脊髄、脑膜、脑、肝和肺转移，5年生存率远低于其他类型乳腺癌[10]。因不表达雌激素受体、孕激素受体、人表皮生长因子受体-2，TNBC缺乏有效的内分泌治疗及精准的靶向治疗，仅仅依赖细胞毒性化疗药物来延缓复发与进展[11]，TNBC是目前治疗最棘手的乳腺癌亚型之一，寻找更有效的靶向治疗位点及预后预测分子也是亟须攻克的难题。

波形蛋白是中间纤维蛋白，作为间叶分化的标志物，是细胞发生上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的重要标志物，EMT与肿瘤细胞侵袭、远处转移相关[5]。波形蛋白在宫颈癌、肺癌，结直肠癌等多种上皮源性肿瘤组织中的表达明显增高[12]。本研究结果显示，TNBC组波形蛋白的阳性表达率高于对照组(P<0.05)，与赵俊军[13]等的研究结果一致。波形蛋白阳性表达患者肿瘤直径为T2或T3期，淋巴结转移为N2或N3，临床分期为Ⅲ期的比例均高于波形蛋白阴性表达患者(均P<0.05)，表明波形蛋白的表达可能与TNBC肿瘤直径、淋巴结转移情况、临床分期有关，波形蛋白可能在TNBC发生和发展发挥重要作用，参与TNBC的增殖、转移，与TNBC的不良生物学行为密切相关。长期随访发现，波形蛋白阳性表达TNBC患者的无病生存率远低于波形蛋白阴性表达患者(P<0.05)，这提示波形蛋白阳性表达TNBC患者的预后较差，在临床工作中可通过检测波形蛋白的表达，对患者预后进行预测，为辅助化疗方案的选择及其他临床决策提供参考。

目前发现骨桥蛋白对肿瘤的增殖、侵袭、自噬、凋亡及血管新生等都具有重要的调节作用[14-15]。郭满等[16]分别观察不同乳腺组织中骨桥蛋白表达的差异，结果表明在TNBC组织中骨桥蛋白的阳性表达率远高于乳腺增生组织和正常乳腺组织。抑制骨桥蛋白表达可促进TNBC细胞自噬和凋亡，从而抑制肿瘤细胞的浸润和转移[16-17]。本研究结果显示，骨桥蛋白在TNBC组织中高表达且骨桥蛋白阳性表达患者肿瘤直径为T2期，临床分期为Ⅱ期或Ⅲ期的比例均高于骨桥蛋白阴性表达患者(均P<0.05)，这表明骨桥蛋白可能与TNBC肿瘤直径和临床分期有关(均P<0.05)，提示骨桥蛋白可能参与TNBC的发生发展。波形蛋白与骨桥蛋白的表达呈正相关(P<0.05)，这表明波形蛋白与骨桥蛋白或许在TNBC的发生和发展中存在调控关系，或许可通过调控例如p38蛋白激酶信号通路表达[17]，进而调控波形蛋白与骨桥蛋白的表达，来实现抑制肿瘤细胞的迁移和转移。经长期随访发现，骨桥蛋白与TNBC预后密切相关，骨桥蛋白阳性表达TNBC患者无病生存率低于骨桥蛋白阴性表达患者(P<0.05)。在临床工作中可检测TNBC患者的骨桥蛋白表达情况，对于骨桥蛋白表达较高的患者，应给予相应的临床重视。

综上所述，波形蛋白与骨桥蛋白在TNBC组织中阳性表达率高，且两者表达情况呈正相关，其在TNBC的发生、发展中可能起协同作用，二者的高表达提示TNBC患者预后不良，在临床上检测二者的表达水平或可评估患者预后，为TNBC的治疗提供临床指导。