液相色谱–串联质谱法测定婴幼儿湿巾中的15 种防腐剂

朱虹，郑增尧，徐宁，杨建英，陈晓红，黄让明

（广东省汕头市质量计量监督检测所，广东汕头 515041)

湿巾富含水和营养物质，极易滋生微生物，需要添加防腐剂抑制微生物的生长［1］。婴幼儿器官发育不成熟，皮肤相对娇嫩脆弱，过量的防腐剂易刺激婴幼儿的粘膜和皮肤，甚至引起皮肤过敏，严重的还会致畸致癌［2］，因此婴幼儿湿巾的质量安全应引起更大的重视。目前，欧盟、美国、加拿大等国家和地区均将人体用湿巾纳入化妆品进行监管，中国台湾地区也将婴儿湿巾纳入化妆品种类管理。加拿大还将消毒湿巾作为非处方药管理。然而，中国内地是将湿巾作为一次性使用卫生用品进行监管［3–11］，对应的两项国家标准GB/T 27728—2011《湿巾》和GB 15979—2002 《一次性使用卫生用品标准》中均没有明确规定防腐剂的限量值和检测方法，因此防腐剂是婴幼儿湿巾质量安全的风险之一。

目前防腐剂的检测方法主要有气相色谱法、气相色谱–质谱法、液相色谱法、液相色谱–串联质谱法、毛细管电泳法等，主要应用于食品和化妆品领域。龚越飞等［12–13］采用超高效液相色谱先后分别对9 种和7 种湿巾防腐剂进行了检测；潘剑婷等［14］用高效液相色谱法测定了湿巾中噻唑啉酮类防腐剂；姚帮本等［15］采用超高效液相色谱–串联质谱法测定了湿巾中5 种异噻唑啉酮类防腐剂；赵金尧等［16］采用气相色谱–质谱法测定了婴儿湿巾中16种防腐剂和抗氧化剂；万富等［17］采用高效液相色谱法同时测定了婴儿湿巾中9 种防腐剂；黄博能等［18］采用气相色谱–质谱法测定了婴幼儿湿巾中的3 种苯扎氯铵。采用液相色谱–串联质谱法测定婴幼儿湿巾中15 种防腐剂的方法尚未见报道。

笔者建立了一种液相色谱–串联质谱法同时测定婴幼儿湿巾中15 种防腐剂的方法，该方法操作简便，灵敏度高，可为婴幼儿湿巾中的防腐剂检测和婴幼儿湿巾的产品质量安全监管提供技术支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱–质谱联用仪：QTRAP 5500 型，美国AB SCIEX 公司。

氮气发生器：Genius 1024 型，毕克气体仪器贸易（上海）有限公司。

电子分析天平：ME 204 型，感量为0.1 mg，梅特勒–托利多国际贸易（上海）有限公司。

旋涡震荡器：Kylin-Bell VORTEX–5 型，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

超声波清洗机：SB25–12DT 型，宁波新芝生物科技股份有限公司。

高速离心机：3–18KS 型，德国希格玛实验室离心机公司。

溶剂过滤装置：配置0.22 μm 有机滤膜和水相滤膜，天津市津腾实验设备有限公司。

标准物质：（1）苄索氯铵（质量分数为98.1%）、十二烷基二甲基苄基氯化铵（质量分数为98.0%）、十四烷基二甲基苄基氯化铵（质量分数为98.7%）、十六烷基二甲基苄基氯化铵（质量分数为99.0%）、甲基异噻唑啉酮（质量分数为99.9%）、2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇（质量分数为98.1%）、对氯间甲酚（质量分数为98.5%），迈迪嘉（天津）科技有限公司；（2）甲基氯异噻唑啉酮（质量分数为99.0%）、苯甲酸（质量分数为99.9%）、4-羟基苯甲酸甲酯（质量分数为98.5%）、4-羟基苯甲酸乙酯（质量分数为99.0%）、4-羟基苯甲酸异丙酯（质量分数为99.0%）、4-羟基苯甲酸丙酯（质量分数为99.0%）、4-羟基苯甲酸异丁酯（质量分数为99.0%）、4-羟基苯甲酸丁酯（质量分数为99.0%），美国A ChemTek 公司。

甲醇：HPLC 级，瑞典欧森巴克化学公司。

氮气：质量分数为99.5%，由氮气发生器制备。

针式过滤器：0.22 μm，天津市津腾实验设备有限公司。

婴幼儿湿巾样品：市售。

实验用水为超纯水。

1.2 实验步骤

1.2.1 样品预处理

将样品剪碎成面积不大于5 mm×5 mm 的小块，称取2.0 g（精确至0.001 g）于15 mL 离心管中，准确加入50%甲醇溶液（体积分数，下同）10.0 mL，在旋涡振荡器上高速旋涡30 s，充分混匀，超声提取20 min，以10 000 r/min 转速离心5 min，准确移取1.0 mL 上清液于10 mL 容量瓶中，用10%甲醇溶液定容至标线，摇匀，过0.22 μm 滤膜，进行液相色谱–串联质谱分析。若样品溶液浓度过高，可用体积分数为10%的甲醇溶液稀释。

1.2.2 标准溶液的配制

分别称取15 种防腐剂标准物质10 mg 于10 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，分别制备成1.0 mg/mL 的单标准储备溶液。准确移取单标准储备溶液相应体积至10 mL 容量瓶中，用10%甲醇溶液稀释并定容，配制成系列浓度的混合标准工作溶液。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 色谱

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱［100 mm×2.1 mm，1.7 μm，沃特世科技（上海）有限公司］；流动相：A 相为水，B 相为甲醇，A、B 相均含有5.0 mmol/L 甲酸铵和0.01%甲酸，流量为0.3 mL/min，梯度淋洗条件见表1；柱温：30 ℃；进样体积：2 μL。

表1 梯度淋洗程序1）

1.3.2 质谱

离子源：电喷雾（ESI）；扫描方式：正源和负源同时扫描；离子源喷雾电压（IS）：正源为5 500 V，负源为– 4 500V；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源加热温度：550 ℃；气帘气（CUR）、雾化气（GAS1）、加热辅助气（GAS2）、碰撞气（CAD）均为高纯氮气；定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞电压等质谱参数见表2。

表2 特征选择离子及质谱参数

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

本实验采用正、负模式同时扫描的方式，在流动相水–甲醇体系中加入甲酸铵可增大目标组分的响应值。分别考察了目标组分在浓度为2.0、5.0、10 mmol/L 的甲酸铵溶液中的响应值，结果表明流动相中含有5.0 mmol/L 甲酸铵时目标组分的离子化程度最高。同时甲酸铵溶液中含有0.1%甲酸溶液时色谱峰形得到显著改善，因此采用水–甲醇（水和甲醇均含有5.0 mmol/L 甲酸铵和0.01%甲酸溶液）作为流动相进行梯度洗脱。15 种防腐剂标准溶液（质量浓度为100 ng/mL）的总离子色谱图见图1 和图2。

图1 6 种防腐剂的总离子色谱图（正模式）

图2 9 种防腐剂的总离子色谱图（负模式）

2.2 提取条件的选择和优化

根据15 种防腐剂的化学性质和婴幼儿湿巾的基质特点，采用有机溶剂直接提取的方式进行样品处理。分别考察了30%、50%、80%甲醇溶液的提取效果，结果表明，3 种不同浓度的甲醇溶液对15 种防腐剂提取效果均较好，其中以50%甲醇溶液的提取率最高，因此选取50%的甲醇溶液作为提取溶剂。

为进一步提高目标组分的提取率，确保方法的稳定性，采取样品旋涡混匀后超声提取的方式。实验发现超声时间超过20 min 以后，各组分的提取率再无明显提高。因而选取超声时间为20 min。在实验过程中还发现，提取液直接进样，保留时间较短的甲基异噻唑啉酮色谱峰形较差，色谱响应值会受溶剂效应的影响。当将提取液用10%甲醇溶液稀释后进样时，由于10%甲醇溶液与初始流动相组成相近，甲基异噻唑啉酮色谱峰形尖锐，可满足实验要求。因此样品提取液采用10%甲醇溶液稀释后进样，系列标准工作溶液也用10%甲醇溶液配制。

2.3 线性方程和检出限

在1.3 仪器工作条件下，对15 种防腐剂的系列混合标准工作溶液进行测定，以各组分质量浓度为自变量、定量离子色谱峰面积为因变量进行线性回归，计算线性方程和相关系数。以空白样品的3 倍信噪比计算检出限［19］，以10 倍信噪比计算定量限。15 种防腐剂质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限列于表3。由表3 可知，在对应的线性范围内，各目标组分的线性良好，相关系数为0.996～0.999 8，方法检出限为0.000 1～2 mg/kg。

表3 线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.4 加标回收试验

称取经检测不含15 种防腐剂的婴幼儿湿巾样品，分别添加高、低两个浓度水平的混合标准溶液，重复测定6 次，计算回收率和测定值的相对标准偏差，结果列于表4。由表4 可知，在高、低两种浓度的加标水平下，15 种防腐剂的平均回收率为83.4%～102.9%。6 次平行测定的相对标准偏差为0.3%～4.9%，表明本方法精密度、准确度均较高。

表4 加标回收试验结果（n=6）

3 结语

建立了液相色谱–串联质谱同时测定婴幼儿湿巾中的15 种防腐剂的方法，该方法操作简便，特异性好，回收率高，灵敏度和准确度及检测时间均能满足工业生产过程的检测要求。该法可为强化婴幼儿湿巾的安全监管提供有力的技术支撑。