大鼠外阴阴道假丝酵母菌病模型感染及治疗后的透射电镜和局部免疫研究*

李 婷，张 旭，白会会,范琳媛,张 展,王素霞,刘朝晖

(1.首都医科大学附属北京妇产医院 a.妇科;b.微生态实验室，北京 100026；2.北京大学第一医院电镜室，北京 100034)

外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginalcandidiasis,VVC)是临床常见妇科疾病，而机会性致病的白假丝酵母菌是其常见病原体。VVC具有顽固复发的特点，而VVC反复发作者往往疗效不理想，导致生活质量下降及相关医疗费用增加[1]。阴道微生态系统是人体四大生态系统中较为复杂的系统，在人类疾病的防御机制方面起着重要作用，由其解剖结构、微生态菌群、局部免疫及机体的内分泌调节功能共同组成。中华医学会妇产科分会感染协作组和中国医师协会妇产科分会共同指出,阴道感染的终极治疗目标是恢复阴道微生态平衡，全面评价阴道感染及治疗前后的阴道微生态系统，指导临床达到恢复阴道微生态环境正常这一最终目标。制霉菌素具有广谱抗真菌作用，属于多烯类抗真菌药，通过破坏真菌的细胞膜,使其内容物外漏而死亡,达到抗真菌的效果，常被用于治疗VVC[2]。临床上，中医药在VVC中的疗效受到越来越多学者们的关注，其具有疗效稳定、毒副作用低、耐药较少等优点[3]。苦参凝胶具有抗菌、抗炎、杀虫止痒、解热镇痛、免疫调节等的功效，可用于湿热瘀滞所致的带下病，对多种阴道感染有良好的治疗效果[4-5]。现建立大鼠阴道真菌感染的阴道炎模型以探讨感染及治疗后阴道超微结构及局部免疫环境的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特殊病原体(SPF)级体重约180～200g雌性未孕Sprague-Dawley(SD)大鼠共40只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证：SCXK(京)2016-0006。全部大鼠在恒温、恒湿的清洁环境中喂养，光照12h明暗交替。本实验经动物管理与使用委员会(IACUC)批准，全过程遵循伦理委员会关于动物实验的相关规定。

1.2 实验药品 制霉菌素阴道泡腾片[中美上海施贵宝制药有限公司，规格：100mg/片，H31022516]，每片含制霉菌素10万IU。坤立舒®苦参凝胶[贵阳新天药业股份有限公司，规格：5g/支(含苦参碱以氧化苦参碱计为100mg)，国药准字号：Z20050058]主要是由苦参总碱、卡波姆940等材料制成的棕色透明胶冻状半固体水溶性凝胶。空白凝胶为除去苦参总碱成分的基质凝胶。苦参凝胶及制霉菌素按大鼠给药剂量根据人和动物间按体表面积折算的等效剂量换算分别为0.5/(kg·d)及1.0×104IU/(kg·d)。

1.3 致病菌及主要试剂 白假丝酵母菌标准株(ATCC-11006)转种于沙保罗琼脂培养基，培养24h，挑取生长良好的菌种悬浮于生理盐水中，调整浓度为1×109/mL，备用。兔抗大鼠IL-4、IL-17、IL-21、IFN-γ抗体购自美国cloud-clone公司。

1.4 方法

1.4.1 建模及给药 大鼠检疫合格后，随机分为正常组、模型对照组、制霉菌素组、空白凝胶组以及中药组，每组8只。造模动物进行卵巢切除手术，正常组仅切除卵巢周围少量脂肪组织。术后第10天皮下注射10mg/kg β-雌二醇，造模后第15天阴道灌注真菌悬液连续11天，感染后第4天取无菌棉拭子插入动物阴道内，阴道分泌物涂片行革兰氏染色验证模型造模成功。随后按分组予以不同的药物进行阴道灌注给药，每天1次，连续14天，正常组与模型对照组予等量生理盐水。停药后第4天动物安乐死病理取材。

1.4.2 病原体转阴率计算 停药后第1天和第4天分别取大鼠阴道分泌物涂片并行革兰染色镜检观察，镜检未检出芽繁殖的芽生孢子和假菌丝定为病原体转阴。转阴率=转阴大鼠数/各组大鼠总数×100%。

1.4.3 苏木精-伊红染色 所有大鼠取阴道中段组织经4%多聚甲醛固定后垂直于管腔面切片，切片行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色，采用Case Viewer数字切片进行病理组织学检查并测量阴道黏膜上皮层数和厚度。

1.4.4 透射电镜观察超微结构 另取小块阴道中段组织经2.5%戊二醛固定液中固后制作电镜切片。环氧树脂包埋，超薄切片机切片后醋酸铀-枸橼酸铅双染色。日本JEM-1200EX透射电镜下观察阴道组织显微结构并拍照。

1.4.5 免疫组化 阴道组织切片后进行IL-4、IL-17、IL-21、IFN-γ免疫组化染色，结果采用免疫组化染色评分(Immunoreative score,IRS)进行评估[6]。IRS总分为阳性细胞百分比与染色强度的乘积。

2 结 果

2.1 大鼠VVC模型造模成功 除正常组外，所有大鼠于感染后第4天取阴道分泌物涂片行革兰氏染色镜检发现白假丝酵母菌假菌丝和(或)芽生孢子，VVC模型造模成功(图1)。

图1 大鼠VVC模型阴道涂片(×1000)

2.2 大鼠阴道分泌物病原体转阴率检测 停药后第1天，模型对照组、制霉菌素组、空白凝胶组及中药组的病原体转阴率存在显著差异(P<0.001)。其中制霉菌素的转阴率最高为87.50%，其次为中药组为75.00%，空白凝胶组为12.50%。模型对照组的转阴率最低为0%。停药第4天，制霉菌素组的病原体转阴率最高为100.00%，其次为中药组为87.50%，模型对照组及空白凝胶组的转阴率为0%，见表1。

2.3 HE染色结果 HE染色下感染模型组及空白凝胶组的阴道黏膜中可见炎细胞浸润，黏膜上皮完整性受到破坏，较正常组黏膜层数及厚度显著降低(P=0.025及P=0.011)，见表2及图2。制霉菌素及中药苦参凝胶治疗后，上皮内可见炎细胞浸润减少，上皮结构未见明显异常，而黏膜层数及厚度与模型组和空白凝胶组无显著差异(P=0.066及P=0.088),见表2及图2，几乎未见间质水肿。

表1 各组大鼠病原体转阴率

表2 各组阴道黏膜组织学特征

图2 各组大鼠阴道组织的HE染色(×200)蓝色箭头:被破坏的阴道黏膜上皮，蓝色框内可见炎细胞浸润

2.4 透射电镜结果 正常大鼠阴道组织中复层上皮细胞间连接紧密，细胞表面微绒毛样结构及糖萼完整(图3A)。感染真菌后(模型对照组及空白凝胶组)部分表面被覆的鳞状上皮缺损，上皮细胞变性、坏死脱落，管腔内可见较多炎性渗出物及坏死组织，黏膜下固有层可见炎细胞浸润；上皮层可见炎细胞浸润，细胞间连接桥粒断裂，细胞间隙增宽，细胞内线粒体显著肿胀变性、基质密度下降，表层细胞表面光滑，未见微绒毛及糖萼(图3B、D)。而经制霉菌素和中药苦参凝胶治疗后，阴道组织中可见局灶线粒体轻度肿胀，细胞内结构未见明确破坏，上皮细胞表面微绒毛及糖萼较模型组增多(图3C、E)。

2.5 免疫组化染色结果 各组间IFN-γ(Th1类细胞因子)及IL-4(Th2类细胞因子)无显著差异(P>0.05)。IL-17在正常对照组的表达较低，白假丝酵母菌感染后表达显著上调(P=0.017)，与空白凝胶组无显著差异(P=0.620)。采用制霉菌素及中药苦参凝胶治疗后,IL-17蛋白表达水平较模型组无明显变化(P=0.620；P=0.324)，但显著高于正常组(P=0.005；P=0.001)。IL-21在正常对照组的表达较低，白假丝酵母菌感染后稍升高但差异不具有显著性(P=0.266)，与空白凝胶组无显著差异(P=0.823)。采用制霉菌素及中药苦参凝胶治疗后,IL-21蛋白表达水平较模型组无明显变化(P=0.123；P=0.123)，但显著高于正常组(P=0.010；P=0.010)。见表3、图4。

表3 各组间大鼠阴道组织中免疫活性因子的表达(n=8)

图3 各组大鼠阴道组织的透射电镜结果

图4 各组间大鼠阴道组织中免疫活性因子的免疫组化结果A:正常组;B:模型对照组;C:制霉菌素组;D:空白凝胶组;E:中药组

3 讨 论

本研究采用VVC大鼠模型，雌性大鼠的生殖道与人类女性有很多相似的微环境[7]。大鼠是啮齿类实验动物，在正常情况下自然免疫能力较强，阴道内不易感染致病菌。文献报道,17-β-雌二醇注射可构建免疫力低下模型，增加大鼠对真菌的易感性，保证VVC建模成功[8]。

本研究结果提示，模型对照组大鼠停药第1天及第4天的病原体转阴率均为0%，提示生理盐水冲洗阴道无法有效清除真菌感染，如不及时治疗真菌会持续感染。制霉菌素作为经典的抗真菌药物，其停药后第4天病原体清除率为100%。苦参凝胶的主要成分是苦参总碱，是目前临床上常用于妇科炎症的中成药。本研究结果证实，苦参凝胶对白假丝酵母菌病原体的清除有一定的作用，但效果稍差于典型的抗真菌药制霉菌素，提示苦参凝胶等中成药可作为VVC治疗的辅助用药，但需与抗真菌药物联用。有体外研究报道，苦参碱有较强的抗真菌活性，能杀灭多种真菌，并且能抑制白假丝酵母菌生物膜的形成及代谢状态，进一步支持本研究结果[9-10]。而不含苦参总碱的空白凝胶停药第1天转阴率为12.5%，而停药第4天的转阴率为0%，其原因可能为停药早期因空白凝胶的冲刷作用出现个别转阴，随后残余真菌复发导致转阴率为0%。

阴道黏膜屏障是由上皮屏障、免疫屏障、微生物群屏障、化学屏障和黏液层等所构成的一种复杂的防御体系，从而可有效地阻挡病原微生物侵入机体。其中糖萼是细胞表面富含多糖的结构，是细胞表面的首要防线[11]。因此，治疗下生殖道感染时，需对该黏膜屏障进行修复重建[12]。阴道组织病理HE染色研究结果证实，制霉菌素及中药苦参凝胶在大鼠VVC模型的阴道黏膜组织病理学修复作用较弱。而在透射电镜下观察大鼠阴道超微结构发现，真菌感染后，细胞间连接桥粒断裂及线粒体显著肿胀变性，阴道上皮表层细胞表面糖萼的脱落消失，与其他学者研究结果一致，糖萼的损伤暴露出上皮细胞的黏附分子，伴有机体炎症反应，炎性因子可加剧黏膜上皮细胞糖萼的损伤，最终导致炎症的发生[13]。糖萼是覆盖于上皮细胞及内皮细胞表面的绒毛状多糖-蛋白复合结构，是上皮屏障的重要组成，同时也是炎症反应时最早被损伤的部位之一，广泛参与血管、黏膜通透性及机体炎症反应的调节，在维持机体内环境、上皮功能及免疫调节方面发挥重要作用[14]。而目前关于阴道上皮细胞表面糖萼功能的研究较少，糖萼的降解与越来越多的病理状态相关，或许成为未来的黏膜修复治疗目标，还没有确定的药物可直接作用于糖萼的保护和再合成，目前对糖萼研究仍停留基础阶段[15]。本研究结果证实，制霉菌素能修复阴道上皮超微结构，维持阴道上皮细胞良好形态，线粒体肿胀程度降低，减轻机体炎症反应，修复并维持上皮微绒毛及糖蕚稳定，可改善阴道上皮的病理状态。而苦参凝胶其主要活性成分为苦参碱类生物碱，有抗炎、抗菌、解热镇痛及加速黏膜修复作用[16]，其对阴道组织超微结构的修复作用与制霉菌素类似。

越来越多的学者认识到阴道局部固有免疫应答与VVC相关的炎症反应的重要性，认为VVC是一种免疫病理学疾病[17]。本研究结果提示，各组间Th1类细胞因子的代表因子IFN-γ水平及各组间Th2类细胞因子的代表因子IL-4水平均无显著差异，Th1类细胞因子介导的细胞免疫应及Th2类细胞因子介导的体液免疫应答可能在制霉菌素及苦参凝胶作用中并未发挥关键抗真菌作用。IL-17及IL-21作为Th17类细胞因子的代表因子，Th17细胞因子能有效地介导中性粒细胞的动员和活化的过程，主要是抗细胞外病原体，在机体抗真菌中发挥着重要作用[18-20]。本研究结果提示，大鼠阴道内接种白假丝酵母菌后，IL-17表达较正常大鼠显著升高以清除致病真菌，与前期小鼠VVC模型研究结果类似[21]。加入制霉菌素或苦参凝胶治疗后，IL-17蛋白稍升高但与模型组无显著差异，两种药物在阴道黏膜免疫功能调节中的作用需增加样本量进一步研究。

VVC的病因及发病机制较复杂、顽固难愈，已成为临床医学的研究热点。目前，阴道黏膜屏障功能与阴道局部免疫调控在VVC致病机制中的作用越来越受到重视。本研究结果证实，真菌感染后大鼠阴道上皮组织被显著破坏，而制霉菌素及苦参凝胶能在体内发挥抗白假丝酵母菌活性，促进受损阴道上皮超微结构尤其是糖萼的修复。而制霉菌素及苦参凝胶在阴道局部抗真菌免疫应答中的作用还需进一步深入研究。