蟾毒灵对黑色素瘤A375细胞的作用及其机制研究

(安庆医药高等专科学校，安徽 安庆 246052)

黑色素瘤是黑色素细胞恶变所产生的， 多见于皮肤色素沉着部，是由于皮肤表皮层的神经嵴黑色素细胞异常增殖所形成的[1]。具有高度恶化、预后差、易转移、对放化疗药物不敏感等特点，易发生血液及淋巴转移，最后转移脑部，高转移性是致死的主要原因，约80%的皮肤癌患者死于黑色素瘤，是皮肤癌类型中死亡率最高的[2]。我国黑色素瘤的发病率占比较欧美国家要低，占肿瘤患者的2%[3]。但是近年来，我国多种肿瘤的发病增长率开始具有明显的下降，但每年患有黑色素瘤的患者仍在持续增长并且呈年轻化趋势[4]。目前常规的方法，像放射、化学药物、靶向药物以及免疫治疗药物等治疗方法，均存在治疗效果差、毒性强、单靶点易产生耐药等诸多问题[5]，所以寻找新型、低毒、治疗效果好的天然药物成为了研究的新方向。

蟾毒灵(bufalin)是从传统中药蟾酥中提取的中药单体，是一种强心类固醇，属于蟾毒甾烯类化合物，是蟾酥中抗肿瘤作用最强蟾毒配基[6]。有研究表明，蟾毒灵具有抗炎、镇痛、强心、抗肿瘤等多种临床功效[7]，在抗肿瘤方面，蟾毒灵在治疗肝细胞癌、食管癌、胃癌、肺癌、前列腺癌等方面都具有较好的药理活性[8-9]，但是在黑色素瘤的治疗上鲜少有人报道。本研究以人黑色素瘤A375细胞为研究对象，探究蟾毒灵对人黑色素瘤A375细胞的增殖作用，并初步探讨其中的分子机制，为进一步深入研究打下基础。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料 人黑色素瘤A375细胞(购自中国科学院上海细胞库)；蟾毒灵(纯度>98%，购自成都曼思特生物科技有限公司，DMSO溶解)；二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)；DMEM高糖培养基、PBS磷酸缓冲盐溶液、青霉素及链霉素双抗溶液、胰蛋白酶(均购自上海碧云天科技有限公司)；胎牛血清(FBS)、 CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、DNA含量检测试剂盒、Bradford法蛋白浓度测定试剂盒、Caspase-3活性测定试剂盒、Caspase-9活性测定试剂盒(均购自上海索莱宝生物科技有限公司)。

1.1.2仪器 二氧化碳培养箱(美国Thermo 公司)；JW-2019HR高速冷冻离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司)；倒置显微镜(日本Olympus 公司)；SpectraMax iD3多功能酶标仪(美国Molecular Devices 公司)； CytoFLEX流式细胞仪(美国Beckman Coulter 公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 取人黑色素瘤 A375 细胞，将其接种于含有10%胎牛血清的 DMEM 高糖培养基中，置于CO2培养箱(37 ℃、5%CO2、饱和湿度)培养，密切观察细胞状态，每1～2天更换培养基，待细胞贴壁铺满培养瓶的70%～80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2CCK-8法测蟾毒灵对A375细胞增殖的抑制作用 取对数生长期的人黑色素瘤A375细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，将其接种于96孔板中，每孔加入100 μL的细胞液，每孔细胞浓度为1×104个/毫升细胞浓度，置于37 ℃、5% CO2培养箱中过夜生长，使细胞贴壁。实验设空白对照组(细胞中加入新鲜的完全培养基)以及蟾毒灵不同浓度组(6.25 nmol/L、12.5 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、400 nmol/L)，每组设置6个复孔。置于培养箱中分别培养 24 h、48 h、72 h后，每孔加入CCK-8试剂10 μl，置于37 ℃、5%CO2培养箱继续孵育1 h后，用酶标仪于波长450 nm处检测各孔的OD值，并计算细胞的增殖抑制率。计算公式为：增殖抑制率=[1-(药物组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。

1.2.3流式细胞仪检测蟾毒灵对A375细胞凋亡的影响 取对数生长期的人黑色素瘤A375细胞，将其接种于6孔板中，每孔细胞密度为1×105个/孔，在37 ℃、5%CO2培养箱中过夜，使细胞贴壁。实验设空白对照组(细胞中加入新鲜的完全培养基)以及蟾毒灵不同浓度组(12.5 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L)，每组设置3个复孔。置于培养箱中培养 48 h后，用胰蛋白酶消化收集每组的细胞，PBS冲洗3次，然后加入1 ml冷PBS洗涤，轻轻震荡使细胞悬浮，1000 r/min，4 ℃离心5 min，弃上清，再用预冷的 PBS重悬并洗涤细胞 3次；将细胞浓度调整为1×106个/毫升；每管加入100 μl的细胞(1×105个/毫升)，按照Annexin V-FITC 试剂盒说明书每管加入5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光反应10 min； 再加入5 μl PI，轻轻混匀，室温避光反应15 min，加400 μl Binding Buffer，于 1 h内采用流式细胞仪检测并分析细胞凋亡情况。细胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.4流式细胞术检测蟾毒灵对A375细胞周期的影响 取对数生长期的人黑色素瘤A375细胞，将其接种于6孔板中，每孔细胞密度为1×105个/孔，置于CO2培养箱中过夜培养，使细胞贴壁生长。实验设空白对照组(细胞中加入新鲜的完全培养基)以及蟾毒灵不同浓度组(12.5 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L)，每组设置3个复孔。置于培养箱培养48 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化收集细胞，将细胞浓度调整为(1～5)×106个/毫升，取1 ml的细胞悬液离心，1000 g，离心3 min；弃上清，用70%预冷酒精混匀，置于4 ℃固定24 h。1000 g，离心3 min，去上清，用PBS洗涤2次。加入0.5 ml碘化丙啶染色液，37 ℃，4 ℃各避光孵育30 min，用流式细胞术检测细胞周期的变化。

1.2.5流式细胞术检测蟾毒灵对A375细胞线粒体膜电位的影响 取对数生长期的人黑色素瘤A375细胞，将其接种于6孔板中，每孔细胞密度为孔细胞密度为1×105个/孔，置于CO2培养箱中过夜培养，使细胞贴壁生长。实验设空白对照组(细胞中加入新鲜的完全培养基)以及蟾毒灵不同浓度组(12.5 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L)，每组设置3个复孔。置于培养箱培养48 h后，用胰酶消化收集各组细胞，按照JC-1线粒体膜电位检测试剂盒说明书，将JC-1染色工作液加入到A375细胞悬液中，37 ℃孵育20 min，随后用JC-1染色缓冲液洗涤2次，用JC-1染色缓冲液重悬A375细胞，采用流式细胞仪检测JC-1线粒体膜电位。

1.2.6分光光度法检测蟾毒灵对A375细胞Caspase-3、 Caspase-9活性的影响 取对数生长期的人黑色素瘤A375细胞，将其接种于6孔板中，置于CO2培养箱中过夜培养，使细胞贴壁生长。实验设空白对照组(细胞中加入新鲜的完全培养基)以及蟾毒灵不同浓度组(12.5 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L)，每组设置3个复孔。置于培养箱培养48 h后，用胰蛋白酶消化收集各组细胞，将细胞浓度调整为(1～5)×106个/毫升，用PBS洗涤3次，用PBS重悬，加入Lysis Buffer，在冰上孵育15 min，10 000g，离心1 min，通过Bradford法定量蛋白质浓度，将样品的蛋白浓度调整为1.0 mg/ml。每组取50 μl的样品蛋白，根据Caspase-3活性测定试剂盒、Caspase-9活性测定试剂盒说明书，加入Caspase-3或Caspase-9 Substrate，37 ℃避光孵育4 h，酶标仪检测405 nm的吸光度值。用未加药对照组与药物组的吸光度(OD)值来表示不同浓度药物组Caspase-3和Caspase-9的活性。

2 结果

2.1蟾毒灵对A375细胞增殖的影响 CCK-8实验表明，不同浓度蟾毒灵(6.25 nmol/L、12.5 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、400 nmol/L)作用于A375细胞24 h、48 h和72 h后，IC50值分别为107 nmol/L、85.18 nmol/L、41.62 nmol/L，IC50值逐渐下降，说明蟾毒灵可明显抑制A375细胞的增殖，并且随着蟾毒灵浓度的增加和作用时间延长，A375细胞活力均有显著下降，呈浓度和时间依赖性，见表1、图1。

表1 不同浓度蟾毒灵对A375细胞增殖的抑制率

与空白对照组比较，*为P<0.05，**为P<0.01。

2.2蟾毒灵对A375细胞凋亡的影响 不同浓度蟾毒灵(12.5 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L)作用于A375细胞48 h后，流式细胞检测术检测结果显示，蟾毒灵的12.5 nmol/L组的A375细胞的凋亡率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L浓度的蟾毒灵作用于A375细胞后的细胞凋亡率显著高于对照组的凋亡率 ，并且呈浓度依赖性，具有统计学意义(P<0.01)，见图2。

2.3蟾毒灵对A375细胞周期的影响 不同浓度蟾毒灵(12.5 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L)作用于A375细胞48 h后，流式细胞检测术检测A375细胞周期，结果显示不同浓度蟾毒灵均可影响A375细胞生长周期，与空白对照组相比，G0/G1期细胞增多，但是无统计学差异，S期细胞显著增加，具有统计学意义(P<0.01)，G2/M期细胞显著减少，表明蟾毒灵诱导A375细胞周期阻滞于S期，随着蟾毒灵浓度的增加，这种作用越显著，差异具有统计学意义，见表2。

图2 不同浓度的蟾毒灵对A375细胞凋亡的影响

2.4蟾毒灵对线粒体膜电位的影响 肿瘤细胞线粒体膜电位的降低是肿瘤细胞早期凋亡的特征之一，不同浓度蟾毒灵(12.5 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L)作用于A375细胞48 h后，采用JC-1染色，流式细胞检测术检测A375细胞线粒体膜电位变化，结果显示空白对照组中仅有少量细胞线粒体膜电位下降，而随蟾毒灵浓度的增加，线粒体膜电位下降的细胞数量逐渐增加，且呈剂量依赖性(P<0.01)，见图3。

2.5蟾毒灵对A375细胞Caspase-3、 Caspase-9活性的影响 不同浓度蟾毒灵(12.5 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L)作用于A375细胞48 h后，用酶标仪检测Caspase-3、Caspase-9 活性的活性，结果显示12.5 nmol/L的蟾毒灵对A375细胞的Caspase-3、 Caspase-9活性差异无统计学意义(P>0.05)，25 nmol/L的蟾毒灵对A375细胞的Caspase-9活性差异无统计学意义(P>0.05)，25 nmol/L的蟾毒灵对A375细胞的Caspase-3活性差异有统计学意义(P<0.05)，50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L浓度的蟾毒灵作用于A375细胞后，与Control组比较，Caspase-3、Caspase-9活性均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见表3、图4。

表2 不同浓度蟾毒灵作用于A375细胞细胞周期分布情况

与空白对照组比，*为P<0.05，**为P<0.01。

3 讨论

黑色素瘤是起源于黑色素细胞恶化转化形成的一种肿瘤，近年来，其发病率及死亡率逐年增加，并呈年轻化趋势[10]，发病后转移迅速，恶性程度高，复发率高，预后差[11]。黑色素瘤发病人数仅占皮肤恶性肿瘤总数的5%，但是死亡人数占比很大[12]，至今为止，黑色素瘤产生的病因和发病机制尚不完全清楚，日光照射、紫外线、遗传、种族等都有可能导致黑色素瘤的发生[13]，临床上治疗黑色素瘤的方法主要包括手术治疗、放射治疗、免疫治疗、化疗等，但是各种治疗手段都具有其局限性[14]，因此，寻找一些新型安全有效的治疗黑色素瘤的药物成了迫切需求。蟾酥是中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍等的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液，经加工干燥而成，其性味甘辛、温，有毒。蟾酥具有抗肿瘤、强心、镇痛、抗炎等广泛的药理活性[15]。 蟾毒灵是蟾酥的主要抗肿瘤活性单体，分子式为C24H34O4，相对分子质量为386.5，对于多种肿瘤细胞都具有治疗作用，包括胃癌、食管癌、肺癌、肝癌、白血病等[16-20]，蟾毒灵抗肿瘤机制可能与抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞分化等有关。

表3 不同浓度蟾毒灵对A375细胞Caspase-3、Caspase-9活性的影响

图4 蟾毒灵对A375细胞中Caspase-3、Caspase-9活性的影响

细胞周期阻滞和细胞凋亡是导致细胞死亡的两种机制，G1、S、G2、M期检查点会严格控制正常细胞的细胞周期进展，改变细胞周期的进展的某个检查点就会导致细胞的异常增殖和肿瘤的发生发展[21]，肿瘤细胞的检查点如果出现缺失就会导致无限增殖，许多抗肿瘤药物作用于特定的检测点来阻滞细胞周期，从而诱导细胞凋亡[22]。

细胞凋亡是程序性死亡形式之一，涉及一系列基因的激活、表达以及调控。在恶性肿瘤中，细胞凋亡机制是最早调节细胞死亡的机制，在肿瘤发生发展的调控上具有重要的作用[23]。凋亡是由多基因严格控制的过程，这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、Caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)可调控细胞凋亡通过切割选择性地切割某些蛋白质[24]。Caspase家族中Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10蛋白在细胞凋亡的过程中都有其参与，Caspase-9前体转变为活化的Caspase-9，活化的Caspase-9可使Caspase-3前体转变产生活化的Caspase-3，引起细胞发生程序性死亡。Caspase-9作为中间纽带链接凋亡的内外源性途径，级联激活Caspase家族因子，扩大凋亡信号，发挥其桥梁功能[25]。Caspase-3是Caspase家族中与凋亡有关的关键分子，是细胞凋亡的执行者[26]，可以由多种因素活化，被激活后，可以导致蛋白酶多聚(ADP-核糖)及与细胞结构、DNA核酸复制、细胞周期等相关聚合酶PARP失活，从而导致细胞凋亡，所以说Caspase-3有“死亡蛋白酶”之称[27-28]。线粒体在凋亡中也起着决定性的作用，线粒体丧失电子转移功能并减少能量的产生，跨膜电位的消失都是细胞通过线粒体途径导致细胞凋亡的标志[29]。JC-1是检测线粒体膜电位的理想的荧光探针，JC-1以多聚体的形式存在在线粒体内，呈红色荧光，表明线粒体膜电位正常，当细胞发生凋亡时，线粒体膜电位去极化，JC-1会从线粒体内释放到胞浆内，以单体的形式存在，发出绿色荧光[30]。

本文研究采用CCK-8法检测不同浓度的蟾毒灵对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖的影响，发现随着浓度和时间的增加，抑制作用增强，呈浓度依赖性和时间依赖性，表明蟾毒灵能够抑制人恶性黑色素瘤A375细胞的增殖。采用流式细胞仪检测蟾毒灵对A375细胞的凋亡的影响，随着蟾毒灵浓度的增加，A375细胞的凋亡率也增加，呈浓度依赖性，表明蟾毒灵能够诱导A375细胞凋亡。采用流式细胞仪检测蟾毒灵对A375细胞周期的影响，蟾毒灵阻滞A375细胞细胞周期在S期。采用JC-1法检测A375细胞的线粒体膜电位的变化，发现随着蟾毒灵的浓度的增加，红色荧光逐渐减少，绿色荧光逐渐增加，表明蟾毒灵可显著降低A375细胞线粒体膜电位，呈浓度依赖性，进一步说明蟾毒灵能够诱导A375细胞凋亡。随着蟾毒灵浓度的增加，Caspase-9、Caspase-3活性显著增高，表明蟾毒灵能够促进A375细胞的Caspase-9、Caspase-3活性。由此可以推断，蟾毒灵可能是通过干预Caspase-3、Caspase-9的蛋白活性，激活Caspase家族，促进A375细胞的凋亡。

综上所述，蟾毒灵可有效抑制人黑色素瘤A375细胞的增殖，促进A375细胞凋亡，且与Caspase信号通路的激活相关。表明蟾毒灵在恶性黑色素瘤治疗中具有潜在应用价值。本研究为黑色素瘤的治疗提供了初步的理论基础和实验依据，并为天然药物应用于临床治疗黑色素瘤提供新策略。