欧李LecRLKs基因表达分析及品种间差异比较

韩红艳,付鸿博,邓素芳,冀爱青,赵宇,杜俊杰*

欧李基因表达分析及品种间差异比较

韩红艳1,付鸿博2,邓素芳1,冀爱青1,赵宇1,杜俊杰2*

1. 晋中学院生物科学与技术系, 山西 晋中 030019 2. 山西农业大学园艺学院, 山西 太谷 030801

探究凝集素类受体蛋白激酶基因()与欧李抗性之间的关系，筛选抗性较高的欧李品种。本研究依据欧李转录组数据筛选出4个基因，利用qRT-PCR进行其在26个欧李品种果实中的表达分析，测定部分品种的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的含量，并与基因表达情况进行关联分析。结果表明：与在各品种中的表达量相对较高，Nongda 5、10-03和JO-1中的表达量高，与其它品种比较有显著差异；表达量高的品种（10-03、JO-1和Nongda 5）的保护性酶含量显著高于表达量低的品种（Y04-26、08-24和03-25）；的表达丰度与果肉色泽存在一定关系，黄色或黄红色果肉品种10-03、09-19、15-02、X17-01和08-16的相对基因表达量较高，可作为为欧李抗逆性选育的优势品种。

欧李; 基因表达; 种间差异

LecRLKs首次在拟南芥中被描述，其家族可分为G、L和C三种类型[1,2]。凝集素类受体蛋白激酶（Lectin receptor-like protein kinases，LecRLKs）被认为在细胞对外部刺激的反应中扮演重要的角色，包括病原体的侵袭和环境胁迫[3]。植物在其生长发育过程中会遇到各种生长逆境，LecRLKs是定位于细胞膜最先感知逆境因子信号的受体，LecRLKs及其相互作用的信号成分构成了植物细胞表面的识别和保护系统，使植物细胞之间交流并与环境相互作用[4,5]。LecRLKs参与了植物的胁迫耐受性，如参与盐胁迫下的信号转导、参与ATP的识别、参与细胞死亡的调控、参与机械损伤的信号调控等[6-9]。植物受到逆境胁迫提高LecRLKs表达量的同时启动自身的防御系统抵抗外界不良环境，抗氧化防御系统被启动，SOD、POD、CAT等含量增加更好的清除细胞内多余的活性氧自由基，抗氧化系统的启动直接关系到植物抗逆性的强弱[10]。

欧李（）樱桃属植物，兼具经济价值和生态价值，抗逆性强。近年来，课题组从多角度研究抗性相关指标，对欧李种质资源进行抗性鉴定和评价是其育种和引种的前提和基础，如：DREB转录因子家族在提高植物抗性方面的研究[11]。欧李凝集素类受体蛋白激酶家族成员中G、C、L-型个数分别为125、43和2个，与其抗逆性密切相关。本文通过qRT-PCR检测26个欧李品种果实中的表达差异，结合果实自身抗氧化防御系统各保护性酶的特征进行分析，为筛选抗逆性品种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料取自山西农业大学欧李种质资源圃(37°23′N, 112°29′E)，选择26个欧李品种于2019年采集样品，其中农大4号欧李果实采集幼果期和成熟期果实，其余25个品种于果实成熟期采样。采样时分别从每个植株上、中、下部采取大小均匀一致，无病虫害的果实10个，重复3次，采集的样品液氮处理后，超低温冰箱（- 80℃）保存备用。

1.2 试验试剂与仪器

TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction kit 试剂盒、反转录试剂盒（TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit）（艾德来）、离心机（Eppendorf 5424）、analytikjena-qTOWER2.2型荧光定量PCR仪（德国）、紫外分光光度计（UV-1700）、SCILOGEX D3024R离心机（美国）、analytikjena-Easycycler（德国），引物合成由北京六合华大基因科技有限公司完成。

1.3 试验方法

1.3.1 总RNA的提取和第一链cDNA的合成按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction kit 试剂盒的说明书提取。反转录按照TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit说明书合成cDNA。

1.3.2 荧光定量分析以反转录后的cDNA为模板，以为内参基因，利用Primer Premier 5设计qRT-PCR引物（表1），分析基因的表达水平（2-△△ct）。

表1 ChLecRLK基因qRT-PCR引物设计

1.3.3 SOD、POD、CAT活性测定选取ChLecRLK表达量高的品种（10-03、JO-1和Nongda 5）和ChLecRLK表达量低的品种（Y04-26、08-24和03-25）测定其保护性酶活性。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑光还原法[12]测定；过氧化氢酶（CAT）活性采用紫外吸收法[12]测定；过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法[12]测定。

1.4 统计学方法

应用boxplot软件分析，Excel、Sigmaplot绘图。

2 结果与分析

2.1 欧李果实中ChLecRLK差异基因筛选

基于农大4号欧李果实转录组数据，共筛选出4个差异基因（、、和），这4个基因在成熟期的表达量明显高于幼果期（图1A）。通过qRT-PCR验证后也发现，这4个基因在成熟期的表达量明显高于幼果期，这与转录组的结果一致。COG功能注释显示：4个所选基因表达产物参与了细胞受到外界信号刺激时所开启的信号转导途径。因此，将这4个基因作为候选基因进行分析。

图1 ChLecRLK基因在转录组的表达情况(A)，qRT-PCR分析ChLecRLK基因的表达情况(B)

2.2 ChLecRLK基因在不同品种欧李果实中的表达分析

通过qRT-PCR分析、、和基因的表达情况可以看出，4个基因在26个欧李品种果实中均表达，且存在品种间差异。在10-03和Nongda 5中的表达量最高与其他24个品种均呈显著性差异（<0.05），在08-24、03-38和Y04-26三个品种中的表达量最低，在03-25欧李果实中不表达。在10-03、JO-1和Nongda 5三个品种的表达量最高且与其他品种呈显著性差异（<0.05），在08-24、03-25和Y04-26等多个品种中的表达量均较低。在09-19和15-02中表达量较高，在其他品种中表达量均较低且均无显著性差异。在10-03和08-16中表达量较高与其他品种呈显著性差异（<0.05），在03-38和03-25中表达量较低。

图2 4个ChLecRLK基因在不同品种欧李果实中的表达分析

注：不同字母表示不同品种中的表达量差异显著（<0.05）。

Note: Different letters in the figure indicates that the expression levels of different varieties were significantly different（<0.05）.

2.3 欧李ChLecRLK基因表达量与果皮、果肉色泽相关性分析

据图3、图4结合表2分析基因的相对表达量与果实色泽的相关性，结果显示：黄色果皮品种中，差异基因、和的表达量偏高，值均落在箱体中，中位线偏下，上相邻值到箱子的距离比下相邻值到箱子的距离长，无异常值，基因表达有一个异常值，品种为09-19。4个基因的表达量值在红色果皮品种之间较为集中，而在黄色果皮品种间差异大，但在红色果皮品种中存在高表达异常值，在品种10-03和15-02表达异常，在品种10-03和JO-1表达异常，在品种15-02表达异常，在品种10-03、15-02和JO-1表达异常。黄色或黄红色果肉品种4个差异基因表达量较高，中位线偏下且值异常品种为10-03、Nongda5号、09-19、15-02、X17-01、08-16和JO-1。表明：的表达量与果实色泽存在一定关系。

表2 欧李果实色泽

图3 欧李果实ChLecRLK差异基因表达水平与果皮色泽的关系

图4 欧李果实ChLecRLK差异基因表达水平与果肉色泽的关系

2.4 不同品种欧李果实中SOD、POD、CAT活性分析

从图 5可知，所选6个品种的果实在成熟期均保持有SOD、POD和CAT活性，Nongda 5和JO-1两个品种的SOD活性较高与其他四个品种呈显著性差异（<0.05），Nongda 5的CAT和POD活性在6个品种中均最高与其他5个品种呈显著性差异（<0.05）。总体来说，基因高表达量的品种（10-03、JO-1和Nongda 5）各保护性酶活性显著高于基因低表达量的品种（Y04-26、08-24和03-25）。

图5 不同品种欧李果实中SOD、POD、CAT活性

注：图中不同小写字母表示差异达0.05显著水平。

Note：Different letters indicate significant difference among differentfruit（< 0.05）.

3 讨论与结论

凝集素类受体蛋白激酶（）是表达识别和传递逆境信号的蛋白分子，它在植物中表达丰度的高低可以作为选育抗逆品种的指标之一[13]。本研究通过对欧李26个品种成熟期果实中4个上调表达量分析，结果显示：、和在品种10-03、15-02、JO-1、09-19、X17-01、08-16和Nongda 5七个品种中的表达量均显著高于其他品种，结合表达量与果皮、果肉色泽相关性的分析，这7个品种中红色果肉占14.2%，黄色果肉占85.8%，表明：的表达丰度与果肉色泽存在一定关系，黄肉品种10-03、09-19、X17-01、08-16和15-02可作为欧李抗逆性选育的优势品种。Nongda 5果实中基因的表达量及保护性酶的活性均与其他品种有显著性差异，今后将其作为亲本对开展欧李抗逆性品种选育具有重要意义。

在植物细胞中SOD、POD和CAT可清除自由基对生物膜的侵害，抑制膜脂发生过氧化，进一步维护生物膜的结构和功能；SOD可通过歧化反应清除自由基生成活性较弱的H2O2，CAT与POD将其还原为H2O[14]，CAT活性增强可以提高植物的抗逆境能力[15]。研究表明，同一植物不同品种[16，17]、不同发育期[18]、不同亚细胞定位[19]及同一器官的不同形状[20]体内抗氧化酶存在明显差异，表现出在抵抗胁迫和适应环境方面的遗传多样性其抗氧化酶活性不同。本研究以3个高表达量品种（10-03、JO-1和Nongda 5）和3个低表达量品种（Y04-26、08-24和03-25）进行SOD、POD和CAT活性测定，结果表明：表达量高其相应的抗氧化防御能力高，二者在植物抗生物/非生物胁迫中存在一定的相关性，将作为今后研究的方向。

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Analysis ofGene Expression inand Comparison of Interspecific Differences

HAN Hong-yan1, FU Hong-bo2, DENG Su-fang1, JI Ai-qing1, ZHAO Yu1, DU Jun-jie2*

1.030619,2.030801,

The relationship between expression of lectin receptor protein kinase gene () and resistance ofselect the varieties with high resistance. In this study, fourup-regulated genes were screened according to the transcriptome data. Their expression abundances were detected in the fruits of 26 varieties ofby qRT-PCR methodAt the same time, the contents of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD) of some varieties were measured to correlate with gene expression.The results showed thatandhad relatively high expression levels in 26 varieties. Compared with other varieties, Nongda 5, 10-03 and JO-1 have high expression levels and the difference was significant. The contents of protective enzymes in varieties with highexpression levels including 10-03, JO-1 and Nongda5 were significantly higher than those in varieties with low expression including Y04-26, 08-24 and 03-25. The expression abundance ofhad relationship with the color of the pulp.differential gene expression levels of yellow or yellow-red flesh varieties including 10-03, Nongda 5, 09-19, 15-02, X17-01 and 08-16 were high. Therefore, they can be used as the dominant varieties for resistance breeding of.

; gene expression; interspecific difference

Q946

A

1000-2324(2021)06-0916-06

2021-08-05

2021-09-04

晋中学院“1331工程”创客团队项目(Jzxycktd2017009);山西省应用基础研究项目(201801D121251)

韩红艳(1976-),女,硕士,副教授,研究方向:果树种质资源研究与创新. E-mail:hhy0822@126.com

通讯作者:Author for correspondence. E-mail:djj738@163.com