利用秀丽隐杆线虫模型评价人工培育肉灵芝浸提物的毒性及抗氧化功效

曹公译, 李晨曦, 马 蕾, 杜林娜, 王丽萍， 刘 艳

(1. 吉林农业大学 生命科学学院, 长春 130118; 2. 吉林大学 生命科学学院, 长春130012)

肉灵芝(meat-likeGanodermalucidum, MGL)， 又称太岁[1]， 因其兼具原生生物和真菌的特点， 又不属于动物、 植物和微生物等常见生物类群， 目前尚无统一的生物学分类， 因而被称为“第四生命体”[1-2], 其富含吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone, PQQ)[3-4]， 具有安神助眠的功效， 对胃肠、 肝肾、 心脑等器质性病变， 糖尿病、 高血压等代谢性系统疾病， 以及肿瘤防治等均有较好的医疗效果[5-8]； 并有助于平衡机体氧化还原稳态[9]、 抑制肿瘤[10]、 抗放射、 提高肝脏、 骨髓、 血液合成DNA、 RNA和蛋白质能力[11]. 作为天然的营养补充剂， 肉灵芝及其浸提物的保健功效明显， MGL比灵芝(GL)[12-16]组成更多样， 功效更全面， 且具有很强的再生能力， 对其药用成分进行研究与开发更具有价值. 但对其药用价值和作用机制仍需进一步的探究和科学性的评价.

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans, 线虫)作为典型的模式生物， 具有个体微小， 周身透明， 生命周期短， 生理现象明确、 易观察， 遗传背景清晰、 成本低、 易操作等优点[17-18]， 广泛应用于抗氧化、 抗衰老、 药物筛选、 遗传进化等领域的研究. 近年来， 以线虫为模型对天然植物、 动物及微生物来源的提取物及其有效成分的药效学和毒理学评价研究日益广泛[19-23]； 以线虫经典的生理指标、 压力诱导及转基因模型等为参考的药效学评价和作用机制探究也取得了重要进展[24-27]. 然而， 以线虫为模型评价肉灵芝及其浸提物抗氧化作用功效及其机制的研究目前尚未见文献报道.

本文以线虫正常和压力诱导条件下生理病理指标为参考， 结合转录组学分析， 探究人工培育肉灵芝浸提物对压力诱导条件下线虫氧化损伤的保护作用及其潜在作用靶点， 为肉灵芝及其有效成分的进一步开发利用提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 仪器、 材料与试剂

BT25S型电子分析天平(上海天平仪器厂)、 MLS-3750型高压灭菌锅(日本SANYO公司)、 GZX-9070 MBE型电热鼓风干燥箱(上海实验仪器厂)、 Centrifuge 5810R型高速低温离心机(德国Eppendorf公司)、 ALPHA 1-4 LD plus型冻干机(瑞士Buchi公司)用于实验试剂配制和肉灵芝浸提物提取、 冻干； UV-2501PC型紫外可见光分光光度计(香港基因有限公司)用于肉灵芝浸提物质控监测； SPL-80型生化培养箱(上海精科仪器有限公司)、 SW-CJ-1FD型超净工作台(苏州苏净集团泰安公司)、 XTL-24型体视显微镜(日本奥林巴斯公司)和手动移液器(北京大龙兴创公司)等用于线虫常规培养和实验操作； Illumina高通量测序平台(美国Illumina公司)用于线虫转录组测序.

野生型秀丽隐杆线虫(Bristol N2)和缺陷型大肠杆菌(EscherichiacoliOP50)均购自美国线虫遗传中心； 肉灵芝参照文献[28]及其改良法经标准规程人工培育， 肉灵芝浸提物经冻干后备用[8]； 酵母提取物和胰蛋白胨购自英国OXOID公司； 琼脂粉、 胆固醇及其他常用试剂均为国产分析纯试剂.

1.2 方 法

1.2.1 肉灵芝浸提液制备

参照标准规程[28]用人工液体培育肉灵芝后， 采用离心的方式固液分离， 收集液体部分即为肉灵芝浸提物(MGL)， 其浸出液呈浓稠黄褐色透明状， 成分及性状稳定， 液质均匀， 其有效活性成分及含量见文献[5-8]. 用培养至对数生长期的E.coliOP50(OD600=0.4～0.6)稀释MGL冻干品至终质量浓度为1.5，2.5，5.0 mg/mL， 相同质量浓度E.coliOP50为空白对照组.

1.2.2 线虫培养

采用固体培养法在线虫生长(NGM)培养基表面涂布E.coliOP50菌液， 待E.coliOP50形成均质菌膜后转移线虫至NGM培养基表面生长、 繁殖并完成整个生命周期， 培养条件维持20 ℃， 饱和湿度95%, 恒温恒湿. 实验选取虫卵进行同期化培养(记为0 d)， 待线虫成长至L4期进行给药处理， 每天转移线虫至含有新鲜E.coliOP50菌膜的NGM培养基中， 并观察线虫的生长和运动状态， 记录存活、 丢失及死亡数量.

1.2.3 线虫生理指标评估

线虫存活率和产卵量是衡量线虫生长状态、 氧化损伤、 衰老及药物毒性作用的经典生理指标[29-30]. 存活率实验选取L4期同期化线虫50只/组进行不同质量浓度MGL给药处理， 采用观察和触碰法记录线虫的生长和生活状态， 将轻微触碰线虫躯干无明显应激反应且咽部无收缩变化视为死亡； 将爬壁干枯或泄殖腔堵塞出现虫袋样线虫记为丢失， 予以剔除. 产卵实验选取同期化产卵期成虫5只/组， L4期预喂食不同剂量MGL处理， 每天转移线虫至新鲜培养基至产卵期结束， 恒温恒湿培养虫卵至孵化， 观察并统计幼虫数记为线虫日产卵量[31].

1.2.4 线虫氧化压力模型构建及氧化损伤评估

活性氧自由基(ROS)可参与并反映机体的生理生化变化及病理过程[32-34]. 热刺激和毒物刺激是诱发机体氧自由基爆发及氧化-还原稳态失衡的主要因素之一. 线虫在35 ℃热刺激和过氧化氢诱导慢性氧化损伤条件下将发生显著的热激应答反应和毒物刺激响应， 表现为存活率降低和体内ROS骤增[35-36].

1) 热激实验. 选取L4期同期化线虫30只/组， 持续喂食3 d不同剂量MGL后， 转移线虫至新鲜培养基中， 于35 ℃恒温恒湿热激诱导10 h， 期间每小时统计线虫存活数量， 将触碰无应激响应且咽部无收缩反应视为死亡.

2) 氧化损伤实验. 选取L4期同期化线虫30只/组， 20 ℃培养条件下持续3 d喂食不同剂量MGL后， 转移线虫至20 mmol/L过氧化氢培养基表面诱导慢性氧化损伤模型， 期间每30 min统计线虫存活数量， 以触碰和咽收缩反应判断线虫存活状态.

3) 氧化损伤评估. 采用2,7-二氯二氢荧光素二乙酯(H2DCFDA)染色法评价线虫体内氧自由基水平. 实验选取L4期同期化线虫100只/组， 持续喂食3 d不同剂量MGL后， 用M9 缓冲液冲洗并收集线虫至离心管中， 离心弃缓冲液， 采用终浓度100 μmol/L H2DCFDA避光静止染色线虫2 h后， M9 缓冲液冲洗线虫表面残余染料， 转移线虫至琼脂载玻片， 荧光显微镜(激发波长485 nm， 发射波长530 nm)观察并拍照.

以上实验均设置3个平行实验重复.

1.2.5 线虫转录组学分析

实验遵循RNA-seq高通量测序分析标准化流程， 将对照组和MGL组线虫收集， 经RNA提取、 mRNA富集和反转录、 PCR富集和文库质控， 用Illumina平台进行测序分析， 从整体水平反映喂食MGL后各组线虫细胞中基因转录情况， 并探究MGL潜在作用靶点.

1.3 数据分析与统计

采用GraphPad Prism 5.01软件进行数据分析； 用Kaplan-Meier方法绘制线虫存活率曲线; 用Log-rank (Mantel-Cox) Test 进行显著性检验分析，p<0.05*表示具有显著性差异,p<0.01**表示极显著差异； 基于BMKCloud(www.biocloud.net)云平台进行转录组学数据分析.

2 结果与分析

2.1 肉灵芝浸提物主要成分分析

文献[5,7]采用BCA法、 定磷法、 苯酚-硫酸法、 显色反应、 NBT-Gly法和比色法等对本批次肉灵芝浸提物进行成分分析， 结果表明, 肉灵芝浸提物含有蛋白质、 核酸、 多糖、 维生素C、 维生素E、 吡咯喹啉醌(PQQ)及游离氨基酸等成分. 对浸提物进行紫外全波长扫描， 结果如图1所示. 由图1可见， 浸提物在227，280 nm处有特征吸收峰， 与醌类和蛋白质的两个特征吸收峰带区相符， 核酸、 多糖和维生素等营养物质不在特征吸收峰带区范围内， 因此肉灵芝浸提物的主要成分为醌类和蛋白质.

图1 肉灵芝浸提物的紫外全波长扫描结果Fig.1 Ultraviolet full wavelength scanning results of MGL extracts

2.2 肉灵芝浸提物对线虫寿命的影响

存活率是评价线虫生理状态及药物毒性作用的重要参考指标. 图2为肉灵芝浸提物对线虫寿命的影响. 由图2可见： 与对照组相比， 2.5 mg/mL的MGL可显著延长线虫寿命(p<0.01**)， 随MGL喂食剂量的增加(5.0 mg/mL)， 对线虫寿命的延长作用不明显； 2.5 mg/mL的MGL可使半数线虫存活23 d， 最长存活35 d， 相比对照组分别延长了43.75%和6.06%. 肉灵芝浸提物对线虫产卵量的影响如图3所示. 由图3可见， MGL组与对照组线虫的产卵量均呈先升高后降低的趋势， MGL组日产卵量和总产卵量均高于对照组， 但无显著性差异. 表明实验条件下肉灵芝浸提物对线虫的毒性作用较低， 且有一定程度的促排卵效果. 因此选择最佳质量浓度为2.5 mg/mL的MGL进行生理指标和抗氧化保护作用的评价研究.

2.3 肉灵芝浸提物对线虫抵抗体外慢性氧化损伤的保护

为验证肉灵芝浸提物对氧化压力诱导条件下线虫的保护作用， 分别构建线虫热激压力和过氧化氢诱导慢性氧化压力损伤模型， 通过线虫存活率的变化评估肉灵芝浸提物的保护作用, 结果如图4所示. 由图4(A)可见， 在35 ℃热激诱导条件下， 预喂食2.5 mg/mL的MGL组较对照组存活率显著增高； 在过氧化氢诱导慢性氧化损伤模型中(图4(B))， 2.5 mg/mL肉灵芝浸提物可显著延长线虫的存活率.

图4 肉灵芝浸提物对线虫抵抗外界氧化压力的影响Fig.4 Effect of MGL extracts on oxidative stress resistance of nematode

在此基础上， 通过染色法定性和定量分析线虫体内氧自由基水平的变化， 结果分别如图5和图6 所示. 由图6可见， 喂食2.5 mg/mL的MGL可显著降低线虫体内ROS水平(p<0.01**)， 表明肉灵芝浸提物具有显著的抗氧化功效， 可保护线虫抵抗热刺激和慢性氧化损伤， 降低线虫体内ROS水平， 发挥抗氧化保护作用.

图5 2.5 mg/mL肉灵芝浸提物对线虫ROS影响的荧光定量分析Fig.5 Fluorescence quantitative analysis of effect of 2.5 mg/mL MGL extracts on ROS of nematodes

图6 2.5 mg/mL肉灵芝浸提物对线虫ROS影响Fig.6 Effect of 2.5 mg/mL MGL extracts on ROS of nematodes

2.4 肉灵芝浸提物抗氧化作用机制

为进一步探究肉灵芝浸提物抗氧化的作用机制， 对MGL组和对照组线虫进行转录组学的对比分析， 结果如图7所示. 经RNA-seq高通量筛选和基因库净化处理， 共获得有效功能注释基因15 569 个， 经差异表达基因筛选(DESeq_EBSeq, FDR=0.001, FC=2)， 共获得上调基因539个， 下调基因549个， 无显著性差异变化基因14 481个(图7(A))； 对其进一步GO富集分析， 筛选生物学过程、 分子功能和细胞组分分支中富集程度最高的前10个节点项， 内含显著性差异表达基因382个； 经KEGG富集分析， 382个差异表达基因共富集到20个信号通路中(7(B))， 参与α-亚麻酸和脂肪酸代谢、 不饱和脂肪酸合成、 泛素调控蛋白水解和内质网参与蛋白质加工， 细胞间信号传导和细胞动态平衡以及寿命调控信号通路基因均显著性高表达. 选择KEGG富集通路中显著富集的9个通路内含基因(21个)进行热图(图7(C))、 蛋白互作(图7(D))和功能注释分析.

图7 喂食肉灵芝浸提物线虫的转录组学分析和潜在靶点挖掘Fig.7 Transcriptome analysis and potential target mining for nematodes fed with MGL extracts

其中基因ech-1.1 (Enoyl-CoA Hydratase)，acox-3/F08A8.4 (Acyl-coenzyme A oxidase)，fat-7 (Fatty-acid desaturase 7)参与调控不饱和脂肪酸生物合成、 碳和多种氨基酸的降解与代谢相关蛋白的表达；F44E5.4/F44E5.5和hsp-70基因与参与剪接体、 MAPK信号通路和内吞作用相关蛋白的表达密切相关； Skp1蛋白家族(skr-5,7,8,9,10,12)和热激蛋白HSP-70参与单肽介导的蛋白质水解和加工； 酰基辅酶A氧化酶、 Skp1蛋白家族、 超氧化物歧化酶(sod-5)可发挥过氧化物酶活性， 调节线虫体内氧化还原稳态的平衡. 喂食肉灵芝浸提物可显著影响脂肪酸去饱和酶、 超氧化物歧化酶、 线粒体内膜易位酶(timm-23)、 热激蛋白家族、 金属硫蛋白-1(mtl-1)和Skp1蛋白家族相关蛋白的表达， 依赖寿命调节信号通路发挥抗衰老和抗氧化的保护作用. 该结果进一步表明， 肉灵芝浸提物也具有潜在的调控脂肪代谢、 促进蛋白合成、 抗氧化和抗衰老的生理保护功效.

综上所述， 本文以秀丽隐杆线虫为模型， 通过线虫存活率和产卵量生理指标、 氧化压力诱导和转录组学方法分析， 综合评价了肉灵芝浸提物的抗氧化作用效果. 结果表明， 肉灵芝浸提物的毒副作用低、 生物安全度高， 可抵抗热刺激和氧化损伤诱发的机体氧化稳态失衡， 从而发挥抗氧化的作用功效. 此外， 肉灵芝还具有潜在的减脂、 促进蛋白合成与抗衰老等保健作用， 为指导国民健康饮食、 抗氧化相关功能食品的开发提供了新思路.