烯效唑对葡萄副梢的影响及氮代谢关键基因表达分析

回依宁，申海林，白瑞雯，闫可，邹利人，张楚，齐晓光，温景辉

（1. 吉林农业大学，吉林长春 130118；2. 吉林省农业科学院果树研究所，吉林公主岭 136100；3. 延边大学园艺学院，吉林延边 133002）

葡萄是世界重要果树，丰产性强，经济效益好，在种植业广受欢迎[1]。据联合国粮农组织（FAO）统计，2019年全球葡萄栽培总面积792万 hm2，总产量6592万 t，约占世界水果总产量的20%[2]。我国葡萄种植面积已达72.8万 hm2，年产量1419.5万 t，在促进农村经济发展、助力农民脱贫致富中发挥了重要作用[3]。

氮是植物生长所需的重要矿质营养元素，氮肥的吸收和同化是植物发育和生长的重要过程[4]，硝酸盐还原酶（Nitrate reductase, NR）、亚硝酸还原酶（Nitrite reductase, NiR）、谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase, GS）、谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase, GDH）和天冬酰胺合成酶（Asparagine synthetase, AS）等在氮代谢中起着至关重要的作用[5-6]。许多研究表明，应用植物化学调控技术可以影响氮素的吸收与利用，调节作物的生长发育和产量形成等[7]。

烯效唑是一种常用的植物生长延缓剂，具有高效、低毒、低残留等特点[8]，在小麦[9-10]、水稻[11-12]、豆类[13-15]等作物上已有较多报道，但在葡萄上的应用研究相对较少。葡萄的夏季管理繁琐，修剪副梢需要大量人工[16]，通过科学使用烯效唑等植物生长调节剂，可减缓副梢生长，对实现葡萄轻简化管理具有重要意义。本试验以‘着色香’和‘香悦’两品种为试验材料，开展了烯效唑调控葡萄副梢生长发育及氮代谢关键基因的表达研究，以期为葡萄副梢生长机理研究及夏季省工管理提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地点及材料

试验地点为吉林省农业科学院果树研究所公主岭葡萄核心技术试验园。试材为‘着色香’和‘香悦’，大棚栽培，树龄7年，砧木为‘贝达’，株行距0.8 m×2.0 m，树形为斜干水平龙干形，常规田间管理。

1.2 使用药剂及处理方法

烯效唑为四川省兰月科技有限公司生产，有效成分含量95%。花前7 d（5月26日），将烯效唑以少量酒精溶解后配制成300 mg·L-1溶液，叶面喷施，每处理10株，以叶面均匀润湿不下滴为宜，喷施时间为当天7:00，药品现配现用。以喷洒清水为对照。

RNA提取采用天根植物多糖多酚RNA提取试剂盒（型号DP441），反转录采用Power ScriptⅡ TM反转录试剂盒（型号6210A），5个氮代谢关键基因引物由吉林省库美生物技术有限公司合成。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 副梢生长测定

于处理后25 d（6月20日），每处理随机选择生长势基本一致的葡萄植株，选取健壮新梢10个，测量新梢第4节位副梢的总长度及该副梢第2节节间长度。

1.3.2 叶片相关指标测定

（1）叶绿素含量测定：于8月20日选取植株中部外围发育良好的20片成龄叶，使用 SPAD-502型手持叶绿素仪进行测定。

（2）叶面积测量：每处理随机选取长势良好成龄叶片10片，用Image J软件（V1.8.0）测量叶面积大小。

1.3.3 五个氮代谢关键基因的半定量 RT-PCR表达分析

（1）在NCBI数据库中查找5个葡萄氮代谢关键基因的DNA序列：谷氨酸脱氢酶基因（VvGDH）、亚硝酸还原酶基因（VvNiR）、硝酸还原酶基因（VvNR）、谷氨酰胺合成酶基因（V v G S）和酰胺合成酶基因（VvAS），并采用Primer 5.0设计引物，以葡萄UBI基因为看家基因（表1）。

表1 引物序列及目的片段大小Table 1 Primer sequence and target fragment size

（2）按时期分别采集‘着色香’和‘香悦’葡萄烯效唑处理和对照的副梢幼嫩叶片。采样时间为处理后6 h、12 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d和10 d，每次采集后及时采用液氮冷冻处理，再放入-80℃冰箱保存备用。

（3）RT-PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，28个循环；72 ℃最后延伸5 min。

（4）使用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

1.4 数据统计与处理

采用Excel 2007和SPSS 22.0软件进行数据处理和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 烯效唑对葡萄副梢生长发育的影响

2.1.1 烯效唑对葡萄副梢长度的影响

由图1可知，300 mg·L-1烯效唑处理对葡萄副梢长度的影响因品种而异。烯效唑处理对‘着色香’的副梢长度有明显的抑制作用，处理后‘着色香’副梢长度仅为33.33 cm，显著低于对照，减少了55.97%。而300 mg·L-1烯效唑处理对‘香悦’葡萄的副梢长度影响不显著。

图1 烯效唑处理对葡萄副梢长度的影响Figure 1 Effects of uniconazole treatment on the growth of shoots

2.1.2 烯效唑对葡萄副梢节间长度的影响

由图2可知，300 mg·L-1烯效唑处理对葡萄副梢节间长度的影响因品种而异。烯效唑处理后，‘着色香’副梢节间长度显著缩短，为11.45 cm，较对照减少22.32%。而300 mg·L-1烯效唑处理对‘香悦’葡萄副梢节间长度影响不显著。

图2 烯效唑对葡萄副梢节间长度的影响Figure 2 Effect of uniconazole on the length of the internode length of accessory shoots

2.2 烯效唑对葡萄叶片生长发育的影响

2.2.1 烯效唑对叶面积大小的影响

由图3可知，300 mg·L-1烯效唑处理后，‘着色香’葡萄叶面积明显减小，仅为172.50 cm2，较对照减少了39.42%。而300 mg·L-1烯效唑处理对‘香悦’葡萄的叶面积大小影响不显著。

图3 烯效唑对葡萄叶面积大小的影响Figure 3 Effect of uniconazole on grape leaf area

2.2.2 烯效唑对叶绿素相对含量的影响

由图4可知，300 mg·L-1烯效唑对葡萄叶绿素的影响因品种而异。在‘着色香’上，烯效唑处理的叶绿素含量为47.05 SPAD，显著高于对照13.89%。在‘香悦’上，300 mg·L-1烯效唑处理的叶绿素含量略高于对照，但差异不显著。

图4 烯效唑对葡萄叶片叶绿素含量的影响Figure 4 Analysis on the difference of uniconazole to chlorophyll content of grape leaf

2.3 烯效唑对‘着色香’葡萄5个氮代谢关键基因表达的影响

如图5所示，在处理后不同时期，5个葡萄氮代谢关键基因的表达呈现一定差异。天冬酰胺合成酶基因（VvAS）在处理后2、4、6 d的表达明显下调；谷氨酸脱氢酶基因（VvGDH）在处理后12 h、1 d、4 d和6 d的表达明显下调；谷氨酰胺合成酶基因（VvGS）在处理后12 h、1 d、2 d、6 d和8 d的表达明显下调；亚硝酸还原酶基因（VvNiR）在处理后12 h、1 d、2 d、4 d、6 d和8 d的表达明显下调；硝酸还原酶基因（VvNR）在处理后1、2、4、8 d的表达明显下调。

图5 五个葡萄氮代谢关键基因在‘着色香’葡萄副梢上的半定量表达结果Figure 5 Results of semi-quantitative RT-PCR detection of the expression of five genes on the accessory shoots of 'Zhuosexiang'

由图6可知，烯效唑调控‘着色香’葡萄副梢生长5个氮代谢关键基因的表达可分为3个阶段，其顺序依次为VvGDH、VvGS、VvNiR→VvNR→VvAS。在烯效唑处理后的12 h时，可检测到3个早期响应基因：VvGDH、VvGS和VvNiR；第1天时VvNR基因开始表达；第2天时VvAS基因开始表达。由于VvNiR基因表现为早期响应且表达贯穿整个调控时期，因此初步推断VvNiR基因可能是烯效唑调控‘着色香’葡萄副梢生长的关键基因。

图6 ‘着色香’上5个氮代谢关键基因处理后不同时期下调表达示意图Figure 6 Down regulated expression of five key genes of nitrogen metabolism in 'Zhuosexiang' at different stages after treatment

3 讨论与结论

烯效唑具有显著提高作物叶片光合能力[17-18]、抑制生长[19-20]、增强抗逆性[21]、增加产量[22]和改善品质[23]等多种效应，有利于抑制植物的营养生长。烯效唑抑制生长的作用机理是阻碍贝壳杉烯到贝壳杉烯酸的氧化脱甲基化反应，使贝壳杉烯酸难以合成，从而切断了赤霉素的生物合成，具有强烈的植物生长抑制活性[24]。通过上述理化功能，使植物体内产生一系列的生理效应，对抑制植物新梢生长具有明显效果。王宝亮[25]在‘夏黑’葡萄上喷施200 mg·L-1烯效唑能显著抑制新梢生长，减小节间长度，抑制副梢萌发，增大果穗，改善果实品质；章世奎[26]在库尔勒香梨新梢旺盛生长期，叶面喷施250～350 mg·L-1烯效唑能有效抑制新梢生长、增加新梢粗度。本试验表明，喷施300 mg·L-1烯效唑有效抑制‘着色香’新梢生长和副梢节间长度，该结果与前人研究结果一致[27-29]。

光合作用是作物生长的重要代谢过程，叶绿素参与光合作用中光能的吸收、传递和转化功能，其含量的多少直接影响植株的光合能力[30]。孟娜[31]研究表明，盐胁迫会使植株叶片中叶绿素含量下降，导致光合器官结构与功能遭到破坏，造成植株生长受阻，而施用烯效唑可以减轻胁迫对植株的伤害，并保持植株正常的光合作用。单莹[32]研究表明，低温胁迫下叶绿素含量降低，而喷施烯效唑可有效缓解低温胁迫对植株的伤害。李宁毅[33]研究表明，干旱胁迫下植株生长受到抑制，叶绿素含量显著降低，光合作用受到抑制，经烯效唑处理后可提高叶绿素含量，抗旱能力也显著增强。本试验中，由于供试材料为大棚栽培，夏季高温季节大棚内易遭受高温胁迫，烯效唑的使用可从一定程度上减轻胁迫影响。与对照相比，300 mg·L-1烯效唑处理可提高叶片叶绿素含量，增强植株抗逆性，这与已有的众多报道结果一致。

氮素是植物重要的营养元素，是限制植物生长和产量形成的首要因素。氨基酸及碳氮代谢途径是影响植物生长的重要代谢途径，低浓度氮营养可抑制生物碱合成以及能量代谢相关活动，而高浓度的氮营养则起促进作用[38]，不同果树种类、同一种类果树的不同器官、组织中氮代谢酶基因对氮用量、施用时间等均有不同响应机制[34]。烯效唑具有延缓地上部生长、促进根系生长的效应[39-40]。本研究中，烯效唑通过影响5个关键氮素酶基因的表达，抑制‘着色香’葡萄副梢生长，这与以往烯效唑能有效抑制营养生长、缩小节间长度和降低株高的研究结果相一致。‘香悦’副梢生长对300 mg·L-1烯效唑调控未有明显作用，可能与品种特性有关，‘香悦’为四倍体，‘着色香’为二倍体，不同倍性品种的植株生长势及内源激素含量差异较大，导致其对烯效唑的调控反应不同。本研究中烯效唑抑制氮素利用的结果与一些在禾本科上的研究报道不尽一致。有研究表明，烯效唑可以促进水稻、小麦的氮代谢，提高氮素同化能力[35-37]。作者认为，烯效唑对氮素的利用差异可能与作物种类、田间环境等相关，其具体机理尚有待于进一步研究。

近年来，控制葡萄营养生长的研究大致分为两方面：一是通过断根、修剪、限根栽培和控制水肥等人为方式来控制；二是利用植物生长调节剂，如矮壮素和烯效唑等化学方式达到控梢的目的[41-42]。本试验中，通过300 mg·L-1烯效唑处理可有效抑制‘着色香’葡萄的营养生长、减小叶面积、提高叶绿素含量，对于实现葡萄园轻简化管理、增强通风透光、提高光合效能具有积极意义。目前，有关烯效唑调控植株生长的研究主要集中在生长状态测定和生理指标变化的研究上，涉及信号转导、基因表达和代谢途径等方面的研究相对缺乏。在新时代农业发展背景下，加强烯效唑调控植物生长机制研究，将有助于人们深入了解植物的生长机制，促进高效植物生长调节剂的研发和利用，为农业高效生产提供理论依据[43]。