四川规模种猪场5种主要疫病的病原学检测

邵 靓，李 春，梁璐琪，周莉媛，何庆雄，周哲学*

（1.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；2.四川省绵阳市动物疫病预防控制中心，四川 绵阳 621000）

非洲猪瘟、口蹄疫、猪瘟、猪伪狂犬病、猪蓝耳病是我国当前规模化猪场危害较为严重的疫病，给养猪业带来了巨大的经济损失。2018 年8月我国辽宁省沈阳市确诊第一起非洲猪瘟疫情，并于短时间内蔓延至全国，给我国养猪业造成了毁灭性的打击，该病目前尚无有效的治疗方法和疫苗。2019年以来，非洲猪瘟病毒出现了多种变异株，与2018 年传入的非洲猪瘟毒株相比，变异株的基因组序列、临床症状、致病力等均发生了明显变化，进一步增加了防控难度。口蹄疫是危害世界各国养殖业最严重的疫病之一，传播速度快、传播途径广，仔猪死亡率极高，疫区发病率可达100%［1］。猪瘟、猪伪狂犬病、猪蓝耳病不仅引起种猪繁殖障碍，还会导致猪体免疫抑制，加重其他疫病的继发感染，干扰疫苗免疫效果。为贯彻落实《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020 年）》，近年来，四川省积极探索规模种猪场主要疫病的净化工作，为摸清规模种猪场主要疫病种类和感染情况，掌握疫病流行特点和趋势，评估净化效果，本研究于2021 年上半年对成都、绵阳、达州、眉山、遂宁5 个市的8 个规模种猪场进行了非洲猪瘟、口蹄疫、猪瘟、猪伪狂犬病、猪蓝耳病5种主要疫病的病原学检测。

1 材料

1.1 主要仪器设备 组织匀浆仪购自美国MP公司；核酸自动提取仪购自天隆生物科技有限公司；CFX96 荧光定量PCR 仪购自美国伯乐公司。

1.2 检测试剂 磁珠法核酸提取试剂盒购自天隆生物科技有限公司；非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司；口蹄疫病毒（A/O/Asia I）荧光定量RT-PCR检测试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所；猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR 试剂盒，猪伪狂犬病毒（gE基因）实时荧光PCR检测试剂盒，猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株与美洲株双重实时荧光RT-PCR 检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR 检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征（类NADC-30 毒株）实时荧光RT-PCR 检测试剂盒，均购自北京世纪元亨公司。

1.3 样品 在成都、绵阳、达州、眉山、遂宁等规模化程度高及整体生物安全水平好的地区，针对已开展动物疫病净化的规模种猪场进行病原学检测。每个地区至少选择1 个种猪场，共选择了8个种猪场（绵阳3个，达州2个，成都、眉山、遂宁各1 个），分别采集场内发病死亡猪的肺、肝、脾、肾以及其他发生明显病变的组织，每份组织大小不超过5 cm×5 cm×5 cm，单独用小自封袋包装并注明编号和组织名称。同一头猪的组织放在一个大自封袋内，-20 ℃保存备用。一头猪的组织作为1头份，共采集组织样品294头份。

2 方法

2.1 样品前处理 将1 头份样品的每种类型组织用无菌剪刀分别剪取约0.05 g，混合后放入裂解管，加入1 mL灭菌PBS（pH 7.2）和陶瓷珠，使用组织匀浆仪匀浆1 min，取出后以8 000 r/min 离心2 min，取上清200 μL进行总核酸提取。

2.2 核酸提取 使用磁珠法核酸提取试剂盒和核酸自动提取仪进行总核酸提取。提取程序按照说明书导入。提取完成后，总核酸置-20 ℃保存备用。

2.3 5种病毒的实时荧光RT-PCR/PCR检测 使用各病毒对应的实时荧光RT-PCR/PCR 检测试剂盒进行核酸检测，操作步骤按照各试剂盒说明书进行。猪蓝耳病首次检测采用猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR 检测试剂盒；分型检测依次采用猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株与美洲株双重实时荧光RT-PCR检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR 检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征（类NADC-30 毒株）实时荧光RT-PCR检测试剂盒。

2.4 结果判定 根据各试剂盒说明书进行结果判定。阳性对照Ct值≤阳性临界值并出现典型的扩增曲线，阴性对照无Ct 值且无特定扩增曲线，试验结果成立。样品Ct值≤阳性临界值并出现典型的扩增曲线，判为阳性；阳性临界值＜样品Ct值＜阴性临界值并出现典型的扩增曲线，判为可疑，需重新取样提取总核酸，再次扩增后进行结果判定，如结果为阳性或仍是可疑，则判为阳性；样品Ct值≥阴性临界值或未出现典型的扩增曲线时，判为阴性。

3 结果

3.1 5种病毒的病原检测结果 所有检测的阳性对照、阴性对照均成立。

从表1 可知，294 头份样品中，非洲猪瘟、口蹄疫、猪瘟、猪伪狂犬病病原检测结果均为阴性，猪蓝耳病检出14 头份阳性，阳性率为4.76%（14/294）。猪蓝耳病阳性组织样品分布于3个种猪场（眉山1 个、绵阳2 个），3 个场猪蓝耳病阳性率分别为12.5%、10%、19.35%。

表1 规模种猪场5种主要疫病的病原检测结果

3.2 猪蓝耳病分型检测结果 将14头份猪蓝耳病阳性组织样品采用荧光RT-PCR检测试剂盒进行进一步分型鉴定，结果显示：绵阳2个场的9头份阳性均为美洲型经典株；眉山1 个场的5 头份阳性样品中，3 头份为类NADC-30 毒株，2 头份为美洲型经典株与类NADC-30 毒株混合感染的毒株。以上结果表明，四川省目前流行的猪蓝耳病毒株以美洲型经典株与类NADC-30 毒株为主，且个别地区存在上述两种毒株混合感染的情况。

4 讨论与建议

随着社会的不断发展，我国养殖业逐渐实现规模化、集约化。近年来，从对全国重点原种猪场主要疫病的监测情况来看，当前我国种猪场呈现病原混合感染多、疫病流行日益严重和复杂的趋势，尤其是2018 年以来非洲猪瘟的传入，进一步加剧了疫病防控的严峻形势。净化种猪动物疫病，降低病原传播风险，有利于生猪产业健康稳定发展，对解决种业发展（种猪业）“卡脖子”关键技术难题具有重大意义。我国口蹄疫防控参照OIE 推荐的“口蹄疫渐进性控制计划（PCPFMD）”路线图实施，按照“因地制宜、分区防治、分型控制”的管理原则，大力推进口蹄疫综合防制策略。依据PCP-FMD 的评估规定，我国目前处于PCP 的第3 阶段，即实行根除流行的控制措施、减少病毒循环［2］。当前，全国原种猪场猪伪狂犬病的净化已初见成效，但是部分场个体阳性率仍较高，短期内净化还存在一定难度。大多数原种猪场的猪瘟已得到了有效控制甚至达到了免疫净化，但要进一步提升防控效果，并在全部种猪场实现猪瘟净化，仍面临着政策、经济、技术等层面的诸多制约因素。原种猪场猪蓝耳病在2015～2016 年出现反弹，与类NADC-30 毒株的传入时间相吻合，使得猪蓝耳病的防控形势更趋复杂［3］。

本研究对四川省内5个市的8个规模种猪场开展了非洲猪瘟、口蹄疫、猪瘟、猪伪狂犬病、猪蓝耳病5 种主要疫病的病原学检测，为全省科学开展种猪疫病的防控与净化提供了技术支撑。从检测结果来看，四川省规模种猪场主要疫病净化工作取得了初步成效，但个别地区还存在猪蓝耳病感染，建议各地在已有净化工作的基础上，进一步完善落实种猪疫病防控措施，加大政策与技术支持力度，从种猪源头控制动物疫病。■