独活寄生汤治疗大鼠膝骨关节炎的作用机制研究

陈俊，郑若曦，叶锦霞，郑春松，张婷，戴雨婷，洪江从，李民，吴广文

(1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；3.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122；4.福建中医药大学附属康复医院，福建 福州 350003)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是中老年人常见的关节疾病，我国60岁以上人群中KOA的患病率大于60%[1]。KOA的主要临床表现为膝关节疼痛、肿胀、僵硬、活动受限，严重影响患者生活质量[2-4]。独活寄生汤出自孙思邈的《备急千金要方》，临床用于KOA的防治，疗效显著[5-8]。我们前期研究[9]发现独活寄生汤能够延缓KOA模型大鼠膝关节软骨退变，但其作用机制尚不明确。相关研究[10]表明，由于炎症等因素影响，骨关节炎软骨组织中的长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)的表达受到干扰，影响软骨细胞胞外基质蛋白的表达。为了探讨独活寄生汤治疗大鼠KOA的作用机制，我们进行了相关动物实验，现总结报告如下。

1 材料与仪器

1.1 实验动物2月龄SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠66只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005。实验方案通过医学动物实验伦理委员会批准。

1.2 实验试剂盐酸氨基葡萄糖胶囊(香港澳美制药公司)，戊巴比妥钠溶液(山东西亚化学工业有限公司)，mirVanaTMmiRNA提取试剂盒、TRIzol(美国Invitrogen公司)，Mir-XTMmiRNA逆转录试剂盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒(日本Takara公司)，PrimeScriptTMRT mRNA 逆转录试剂盒、AceQqPCR SYBR Green Master Mix试剂盒(中国Vazyme公司)，苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司)、抗聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原蛋白(CollagenⅡ)抗体(美国Abcam公司)，抗β-肌动蛋白(β-actin)抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G二抗(美国CST公司)，SuperLumia HRP底物ECL高敏试剂盒(美国Abbkine公司)。

1.3 实验仪器NanoDrop 2000超微量分光光度计(美国Invitrogen公司)，PCR仪(美国Bio-rad公司)，7500 Fast实时定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)系统(美国ABI公司)，高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，凝胶电泳系统(美国ThermoFisher公司)，小型槽式转印系统、化学发光成像系统(美国Bio-rad公司)。

2 方 法

2.1 独活寄生汤制备方法独活寄生汤药物组成：独活9 g，桑寄生、牛膝、杜仲、秦艽、防风、肉桂、细辛、当归、川芎、熟地黄、白芍、人参片、茯苓、甘草片各 6 g。将上述药物捣碎，按照固液比1∶10加入蒸馏水，煎煮1.5 h，过滤，加入等量冷水再次煎煮；连续煎煮3次，将3次药液合并后，采用旋转蒸发器浓缩后真空干燥，收集干粉于-20 ℃保存备用；使用时称取干粉加入蒸馏水溶解，配制浓度为0.93 g·mL-1。

2.2 模型建立与干预方法将66只大鼠适应性喂养1周后，随机选取48只大鼠，采用改良Hulth法[9]建立大鼠KOA模型，随机选择3只正常大鼠和3只建模大鼠进行鉴定。证实建模成功后，将剩余的15只正常大鼠纳入正常对照组，采用随机数字表将剩余的45只KOA模型大鼠分为KOA模型组、独活寄生汤治疗组、盐酸氨基葡萄糖治疗组，每组15只。参照“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值”[11]计算大鼠给药量，正常对照组和KOA模型组大鼠按照每天10 mL·kg-1以0.9%生理盐水灌胃，独活寄生汤治疗组大鼠按照每天10 mL·kg-1以独活寄生汤(浓度为0.93 g·mL-1)灌胃，盐酸氨基葡萄糖治疗组按照每天10 mL·kg-1以盐酸氨基葡萄糖溶液(浓度为0.015 g·mL-1)灌胃，连续干预12周。12周后，于腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠，使用剂量2 mL·kg-1。切取双侧胫骨近端和股骨远端的软骨组织，置入-80 ℃冰箱中，储存备用。

2.3 大鼠胫骨近端软骨组织中miR-675-3p检测方法取各组大鼠胫骨近端软骨组织，分别加入液氮研磨至细末，称取25 mg，用mirVanaTMmiRNA提取试剂盒提取总RNA。取1 μg的RNA，采用Mir-XTMmiRNA逆转录试剂盒生成cDNA。采用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行RT-qPCR检测miR-675-3p的表达，以U6为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算miR-675-3p的相对表达量。PCR扩增引物见表1。

2.4 大鼠胫骨近端软骨组织中lncRNA H19及软骨组成相关基因mRNA检测方法取各组大鼠胫骨近端软骨组织，分别加入液氮研磨至细末，称取25 mg，采用TRIzol法提取总RNA，取1 μg的总RNA，采用PrimeScriptTMRT mRNA逆转录试剂盒生成cDNA。采用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒进行RT-qPCR检测lncRNA H19和Aggrecan mRNA、CollagenⅡmRNA的表达，以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算lncRNA H19和Aggrecan、CollagenⅡmRNA的相对表达量。PCR扩增引物见表1。

表1 PCR扩增引物序列

2.5 大鼠股骨远端软骨组织中软骨组成相关基因蛋白检测方法取各组大鼠股骨远端软骨组织，分别加入液氮研磨至细末，称取20 mg，加入200 μL含1 mmol·L-1PMSF的RIPA裂解液，提取总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液并置于沸水中煮5 min。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，每孔加入30 μg蛋白。采用湿转法将凝胶上的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，室温封闭1 h，加入抗Aggrecan、CollagenⅡ、β-actin抗体(抗体稀释比例为1∶1000)孵育过夜，TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，采用SuperLumia HRP底物ECL高敏试剂盒显影，并拍照保存。采用Image Lab软件处理图片，提取蛋白条带的灰度值，并以β-actin蛋白为基准进行标准化处理，计算蛋白条带的相对灰度值，比较蛋白的相对表达水平。

2.6 数据统计方法采用SPSS22.0统计软件对所得数据进行统计学分析。4组大鼠关节软骨组织中miR-675-3p、lncRNA H19、Aggrecan mRNA、CollagenⅡmRNA和Aggrecan蛋白表达量的组间比较均采用Welch或Brown-Forsythe检验，组间两两比较均采用Games-howell检验；4组大鼠关节软骨组织中CollagenⅡ 蛋白表达量的组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

3 结 果

3.1 大鼠饲养结果KOA模型组大鼠因肺栓塞死亡2只，独活寄生汤治疗组大鼠因腹泻死亡1只，盐酸氨基葡萄糖治疗组大鼠因肺栓塞死亡1只。

3.2 大鼠胫骨近端软骨组织中KOA相关基因的RNA表达结果正常对照组、KOA模型组、独活寄生汤治疗组、盐酸氨基葡萄糖治疗组大鼠胫骨近端软骨组织中miR-675-3p、lncRNA H19、Aggrecan mRNA、CollagenⅡmRNA的表达量比较，组间差异均有统计学意义。KOA模型组、独活寄生汤治疗组、盐酸氨基葡萄糖治疗组大鼠胫骨近端软骨组织中miR-675-3p、Aggrecan mRNA、CollagenⅡmRNA的表达量均低于正常对照组(miR-675-3p：P=0.000；P=0.003；P=0.002；Aggrecan mRNA：P=0.000；P=0.000；P=0.000；CollagenⅡmRNA：P=0.000；P=0.000；P=0.000)；KOA模型组大鼠胫骨近端软骨组织中lncRNA H19的表达量低于正常对照组(P=0.002)，独活寄生汤治疗组、盐酸氨基葡萄糖治疗组大鼠胫骨近端软骨组织中lncRNA H19的表达量与正常对照组比较，差异无统计学意义(P=0.058，P=0.069)；独活寄生汤治疗组、盐酸氨基葡萄糖治疗组大鼠胫骨近端软骨组织中miR-675-3p、lncRNA H19、Aggrecan mRNA、CollagenⅡmRNA的表达量均高于KOA模型组(miR-675-3p：P=0.000；P=0.000；lncRNA H19：P=0.000；P=0.000；Aggrecan mRNA：P=0.000；P=0.000；CollagenⅡmRNA：P=0.000；P=0.000)；独活寄生汤治疗组大鼠胫骨近端软骨组织中miR-675-3p、lncRNA H19、Aggrecan mRNA、CollagenⅡmRNA的表达量与盐酸氨基葡萄糖治疗组比较，组间差异均无统计学意义(P=0.922；P=0.778；P=0.857；P=0.904)。见表2。

表2 4组大鼠胫骨近端软骨组织中miR-675-3p、lncRNA H19及软骨组成相关基因的mRNA相对表达量

3.3 大鼠股骨远端软骨组织中软骨组成相关基因的蛋白表达结果正常对照组、KOA模型组、独活寄生汤治疗组、盐酸氨基葡萄糖治疗组的大鼠股骨远端软骨组织中Aggrecan和CollagenⅡ的蛋白表达量比较，组间差异均有统计学意义。KOA模型组、独活寄生汤治疗组大鼠股骨远端软骨组织中Aggrecan的蛋白表达量均低于正常对照组(P=0.003；P=0.004)，盐酸氨基葡萄糖治疗组大鼠股骨远端软骨组织中Aggrecan的蛋白表达量与正常对照组相比，差异无统计学意义(P=0.078)，KOA模型组、独活寄生汤治疗组、盐酸氨基葡萄糖治疗组大鼠股骨远端软骨组织中CollagenⅡ的蛋白表达量均低于正常对照组(P=0.000；P=0.028；P=0.018)，独活寄生汤治疗组、盐酸氨基葡萄糖治疗组大鼠股骨远端软骨组织中Aggrecan和CollagenⅡ的蛋白表达量均高于KOA模型组(Aggrecan：P=0.025；P=0.034；CollagenⅡ：P=0.003；P=0.004)，独活寄生汤治疗组大鼠股骨远端软骨组织中Aggrecan和CollagenⅡ的蛋白表达量与盐酸氨基葡萄糖治疗组比较，组间差异均无统计学意义(P=0.999；P=0.775)。见表3、图1。

表3 4组大鼠股骨远端软骨组织中软骨组成相关基因的蛋白相对表达量

Aggrecan：聚集蛋白聚糖；CollagenⅡ：Ⅱ型胶原蛋白；β-actin：β-肌动蛋白；①正常对照组；②膝骨关节炎模型组；③独活寄生汤治疗组；④盐酸氨基葡萄糖治疗组。

4 讨 论

LncRNA是一类没有编码蛋白质功能的RNA，曾被认为是转录过程中产生的“噪音”。随着研究的进一步深入及高通量测序等技术的应用，多项研究发现lncRNA广泛参与基因的转录、翻译及蛋白的相互作用等生物学过程[12-15]。miRNAs在人类的体液如血液、尿液、关节液及唾液中能够稳定存在，且具有良好的组织特异性和时序性，miRNA在骨关节炎的早期诊断及治疗方面具有较大优势[16]。研究表明，lncRNA和miRNA在骨关节炎发展进程中发挥重要作用[17]。Song等[18]研究发现，与正常软骨组织比较，骨关节炎患者软骨组织中lncRNA的表达异常，而lncRNA的表达异常可能导致软骨细胞胞外基质降解。Fu等[19]采用微阵列分析技术分析骨关节炎患者的软骨组织样本，结果显示，与正常软骨组织相比多个lncRNA上调或下调，认为lncRNA可能是诊断和治疗骨关节炎的潜在生物标志物。

LncRNA H19是最早发现的lncRNA之一，其在转录过程中被加工为miR-675-3p和miR-675-5p；miR-675-5p在软骨组织中表达量较低，且没有靶目标，逐渐被核酸酶降解；因此，miR-675-3p是lncRNA H19在软骨组织内影响细胞外基质的主要活性形式[20-21]。Shen等[22]研究发现，在骨关节炎患者的软骨组织中，miR-675-3p的表达量下降，且在体外以白细胞介素-1干预正常的人软骨细胞后，miR-675-3p的表达量下降。本研究发现KOA模型组大鼠膝关节软骨组织中miR-675-3p和lncRNA H19的表达量均低于正常对照组，独活寄生汤治疗组大鼠膝关节软骨组织miR-675-3p和lncRNA H19的表达量均高于KOA模型组，表明独活寄生汤能够促进KOA模型大鼠膝关节软骨组织miR-675-3p和lncRNA H19的表达，提示其可能通过上调miR-675-3p和lncRNA H19的表达发挥治疗KOA的作用。

Aggrecan和Collagen Ⅱ是软骨细胞胞外基质的重要组成成分，其相互交错形成网状结构增强了软骨的机械强度，使得膝关节软骨能够抵抗较强的剪切力[23]。研究表明，Aggrecan和CollagenⅡ能够被基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)家族蛋白降解[24]。MMP-1和MMP-13具有较强的软骨细胞胞外基质降解能力，其中MMP-13对Collagen Ⅱ的降解能力是MMP家族蛋白中最强的[25]。Seidl等[20]研究发现，通过脂粒Lip2000转染人软骨细胞沉默miR-675-3p能够上调MMP-1和MMP-13的表达。Dudek等[26]研究发现，在正常人软骨细胞中沉默lncRNA H19或miR-675均会降低CollagenⅡ表达，而过表达miR-675会增加CollagenⅡ表达。本研究发现KOA模型组大鼠膝关节软骨组织中Aggrecan、CollagenⅡ mRNA和蛋白的表达量均低于正常对照组，采用独活寄生汤治疗的大鼠膝关节软骨组织中Aggrecan、CollagenⅡ mRNA和蛋白的表达高于KOA模型组；推测lncRNA H19和miR-675-3p的表达上调能够促进Aggrecan和CollagenⅡ表达，但至于独活寄生汤是如何调控lncRNA H19和miR-675-3p，尚需后期进一步深入研究。

本研究结果表明，独活寄生汤治疗大鼠KOA的作用机制，可能与其能够上调miR-675-3p、lncRNA H19的表达进而促进Aggrecan、CollagenⅡ的表达有关。