白臀长尾猴血常规两种测定方法的应用

王瑛莹，朱向蕾，周立晨

(上海动物园, 上海 长宁 200335)

白臀长尾猴(Cercopithecusneglectus)属灵长目(Primates)、猴科(Cercopithecidae)、长尾猴属(Cercopithecus)，是20多种旧大陆猴中的一种，属野生珍稀物种。国内外资料文献关于白臀长尾猴的研究主要集中于饲养、繁殖和行为学等方面[1-2]，相关的血液学方面的研究较少，尚无血常规检测指标的相关资料。为进一步了解人工圈养条件下这一野生珍稀物种的生理学特点及生物学特性，本试验以圈养的9只成年白臀长尾猴为研究对象，用两种方法测定其血常规指标并进行对比分析 ； 同时，以人工显微镜检法测得数据为参照标准，对全自动血液分析仪和人工显微镜检法检测白臀长尾猴血细胞数据进行分析，探讨两者之间的差异性，为拓展白臀长尾猴血液生理指标的测定方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 血液样本 采自上海动物园圈养白臀长尾猴的血液样本共9份，全部为成年健康个体，其中雌猴3只，雄猴6只。收集到血样置于 EDTA-K2真空抗凝管中轻轻颠倒混匀，室温条件下保存备用。

1.2 检验方法

1.2.1 仪器与人工计数稳定性 本实验室的仪器检测和人工计数检测两种方法稳定可靠，笔者之前采用较为成熟的金丝猴(Rhinopithecus)血液样本为对象对两种方法做过验证，经验证，仪器法和手工计数稳定可靠[3]。

1.2.2 人工镜检计数 取血液样品20 μL，加入2%冰醋酸380 μL，稀释样品并破坏红细胞，混匀，持续振荡5 min，取适量混匀液滴入血细胞计数板中，显微镜下计数4个大方格内白细胞总数n，则白细胞数量为(n/20)× 109个/L；取血液样品20 μL，加入0.9%NaCl溶液3 980 μL，稀释血细胞，充分混匀后取适量滴入血细胞计数板中，显微镜下计数5个中方格内红细胞总数m，则红细胞数量为(m/100)×1012个/L。取3 μL血液制成6 cm×2.5 cm血涂片，用瑞氏-吉姆萨染液染色后用低倍镜观察血涂片的细胞分布情况，选择血涂片体尾交界染色良好处，用油镜计数100个白细胞进行白细胞分类[4]。检测环境温度为25 ℃左右。

1.2.3 仪器检验 采用迈瑞BC-5000Vet 兽用全自动血液细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)进行白臀长尾猴血常规仪器检测。严格按照血细胞分析仪的要求定期对血液分析仪进行校准，操作步骤严格按照仪器的标准操作规程进行，并记录好分析结果是否异常。

1.3 统计学方法 采用 SPSS 23.0统计学软件进行数据分析，计量数值以平均值±标准差(Mean±SD)表示，对测定的数据进行正态分布检验(样本量不足50，采用Shapiro-Wilk检验)。对应的人工计数和仪器计数两组数据均符合正态分布的数据应用配对样本t检验比较差异性，两组中只要有一组不符合正态分布的数据应用非参数检验(两个相关样本：Wilcoxon带符号秩检验)比较差异性。采用Spass和Excel做相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人工法和仪器法检测白臀长尾猴血常规 白臀长尾猴的血液样本分别用人工镜检和全自动血液细胞分析仪进行检测，每次检测前都要轻轻颠倒摇匀血液样本。检测结果见表1、表2。

表1 白臀长尾猴血常规人工检测结果Table 1 Complete blood count of Cercopithecus neglectus by manual method

表2 白臀长尾猴血常规仪器检测结果Table 2 Complete blood count of Cercopithecus neglectus detected by instrument method

2.2 仪器法与人工镜检法检测白臀长尾猴血细胞计数比较 两种方法检测白细胞、红细胞密度差异均不显著(配对t检验，P>0.05)(表3)。表明仪器法与人工镜检法应用于白臀长尾猴白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白含量分析结果基本一致。白细胞分类计数中中性粒细胞比率差异不显著(配对t检验，P>0.05)，淋巴细胞比率(配对t检验)、嗜碱性粒细胞比率(配对t检验)、单核细胞比率(Wilcoxon符号秩检验)、嗜酸性粒细胞比率(Wilcoxon符号秩检验)组间结果具有显著性差异。表明应用仪器快速检测白臀长尾猴外周血白细胞分类计数结果不理想。

表3 人工镜检和仪器检测血常规指标统计结果Table 3 Statistical results of complete blood count detected by manual and instrument detection

2.3 仪器法与人工镜检法检测白臀长尾猴血细胞结果相关性分析 为了验证仪器法是否可以代替人工计数法用于白臀长尾猴血细胞快速准确分析，对两种计数方法进行相关性分析。两种检测方法的主要线性回归参数见图1。白细胞、红细胞、淋巴细胞比率、中性粒细胞比率人工镜检法和自动分析仪检测法两种方法具有极强相关性。两种方法检测血红蛋白结果呈现强相关性。单核细胞比率两种检测方法结果呈中等程度相关。

图1 仪器法与人工镜检法检测结果线性相关分析Fig.1 Linear correlation analysis between the results of instrument and manual detectionA:白细胞计数； B: 红细胞计数； C: 血红蛋白含量； D: 红细胞压积； E: 淋巴细胞比率； F: 单核细胞比率； G: 中性粒细胞比率A: Leukocyte count; B: Red blood cell count; C: Hemoglobin content; D: Hematocrit; E: Lymphocyte ratio; F: Monocyte ratio; G: Neutrophil ratio

3 讨论

血液生理常值是反映机体状况的主要指标,也是疾病诊断和监测的重要指标之一[5]。目前，尚未有针对白臀长尾猴血液生理特性方面的研究，展开其血液生理指标方面的基础研究和探索，将对其饲养繁殖、健康状况监控、血液学特性研究、生长代谢等方面具有重要的意义。同时为动物园野生动物血液生理生化参考值数据库的建立提供补充，进而全面提升动物园在珍稀濒危物种保护工作中的作用。

本试验利用仪器法和人工镜检法两种方法测定的雄性白臀长尾猴的白细胞、红细胞、血红蛋白等血液生理指标均略高于雌性，这与同为旧大陆猴的食蟹猴[6]、猕猴[7]血液生理三项指标结果一致。代解杰等、周建华等测定的猕猴三项指标则雌性略高于雄性[8-9]，出现这些差异的原因,可能在于动物血液生理生化指标虽反映了机体状况,但指标的测定不仅受到动物年龄、性别、生理状态、生活环境、营养水平的影响,还受到测定方法以及动物的采食、捕捉时剧烈运动、应激等多种因素的影响[10]。本试验中两种方法测定白臀长尾猴雌雄生理指标红细胞分布宽度-CV有显著差异，其他值均无显著差异。本试验对圈养白臀长尾猴的血液生理指标进行了初步探索,但鉴于动物个体数量有限，关于白臀长尾猴的血液生理指标参考值尚需进一步完善，尽管如此，本试验提供的相关血液生理指标为进一步制定和完善白臀长尾猴的血液生理指标提供重要参考。

血细胞分析仪在野生动物疾病的诊断中有重要的应用价值，对提高诊断效率以及准确率，为病患争取治疗时间有积极意义，同时，仪器法较人工镜检具有更好的稳定性和重复性[11]，因此，探索全自动血细胞分析仪检测白臀长尾猴血常规的可行性具有十分重要的意义。迈瑞BC-5000Vet全自动血细胞分析仪目前有犬、猫、猴、羊、牛等检测通道，猴的检测通道是以猕猴为模型设置仪器参数及参考值，依据白臀长尾猴的种属，本试验白臀长尾猴血液检测通道选择猴(Primates)。把人工计数作为检验标准，分析两种方法计数结果的差异和相关性，来判定全自动血液细胞分析仪检测白臀长尾猴血常规的可行性。两种检测方法测定的白细胞、红细胞、血红蛋白含量结果无显著差异，且表现出较强的相关性，表明仪器法与人工法应用于白臀长尾猴白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白含量分析结果基本一致。进一步对白细胞分类计数进行分析，发现只有中性粒细胞比率两者差异不显著且具有极强相关性，而淋巴细胞比率、单核细胞比率、嗜酸性粒细胞比率、嗜碱性粒细胞比率两种方法表现出显著差异(P<0.05)，表明以当前实验条件和参数设置条件下，全自动血液细胞分析仪不能很好反应白细胞中淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的占比。

临床上，血细胞分析仪在进行全血细胞分析以及白细胞分类时，会存在一定的假阳性，容易导致临床误诊，在准确、详细识别白细胞的形态，特别是的重要组成部分。我院编写了《马场实习手册》，用以规范教学目标、培养计划和考核方式。专门指定有核红细胞、单核细胞、异形淋巴细胞、原始细胞以及幼稚细胞的形态方面仍存在缺陷[12]。此外，很多幼龄动物造血功能相当的活跃，造成外周血中常见多种幼稚细胞，如有核红细胞、中、晚幼粒细胞等，这些幼稚细胞往往仪器分析结果造成较大干扰，以使仪器不能对它们进行正确的分类。如果过度依赖仪器检测的结果从此忽略了白细胞人工显微镜检查，可能会造成疾病的误诊和漏诊，导致不合理的治疗[13]。本试验发现，全自动血细胞分析仪在白臀长尾猴的红细胞、白细胞、血红蛋白检测中效果较为理想，针对白细胞分类计数需联合血涂片进行镜检，以保证检查结果的准确性。