畜禽肉及鸡蛋等动物源性食品中44种多兽药残留检测超高效液相色谱-串联质谱法

张念英，禚欢欢，郭 冰

（日照市市场监管检验检测中心，山东日照276800）

随着人们生活水平的提高，动物源性产品消费量越来越大，产品中兽药残留问题逐渐成为人们普遍关注的社会热点问题。兽药被广泛用于治疗或者预防动物疾病，近年来我国畜牧业迅猛发展，由于缺乏科学饲养知识和利益驱使，一些养殖户在养殖过程中超量、超范围使用兽药，或不遵守休药期规定提前宰杀，导致违禁药物检出、兽药残留检测超过国家标准规定现象逐年攀升[1-2]，给整个畜禽养殖行业带来巨大经济损失的同时也对消费者健康造成了极大威胁[3]。动物源性食品种类繁多，样品基质复杂，兽药目标物种类和组分较多，检测方法多，常用的兽药残留检测方法有液相色谱法[4]、液相色谱-质谱联用法[5-7]、气相色谱法[8]、气相色谱-质谱联用法[9]等。超高效液相-串联质谱（LC-MS/MS）作为一种高灵敏度、高选择性的检测方法，越来越多应用于动物源样品中多兽药残留检测[10-12]。

目前，相关标准和文献报道的兽药残留检测多以某一类兽药检测为主，同时测定的多类兽药残留方法较少。一次样品处理只检测一类药物，虽然针对性强，但若需对一个样品检测多类兽药残留，需要进行多次样品前处理，检测周期长、成本高、效率低。因此，建立一种同时检测动物源性食品中多种兽药残留的检测方法极其必要。

选取猪肉、鸡肉、鸡蛋3种代表性基质，通过Prime HLB通过固相萃取柱净化除去磷脂等杂质，一次前处理可满足对44种兽药残留组分的提取及净化，同时结合LC-MS/MS，实现了对畜禽肉及鸡蛋等动物源性食品中常见兽药残留组分的多残留同时检测，具有操作简单、快速、可靠、准确等特点，可以作为应急保障、风险排查等需要快速响应的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

QTrap 4500型高效液相色谱-质谱联用仪，美国SCIEX公司产品；3-18KS型高速冷冻离心机，德国SIGMA公司产品；ET3301A型水浴氮吹仪，欧陆科技产品；KQ-500DE型数控超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；IKA MS3 basic型高速均质仪，德国IKA公司产品；PRESSURE+48型固相萃取装置，瑞典Biotage公司产品；ME1002E型天平（梅特勒感量0.01 g），XPE205型分析天平（梅特勒感量0.01 mg）；移液器，德国Eppendorf公司产品。

1.1.2 试剂

标准品：44种标准品及6种内标物，德国DR公司或上海CNW公司提供，纯度均大于95%；甲醇（色谱纯，CNW）；乙腈（色谱纯，CNW）、甲酸（色谱纯，CNW）、乙酸乙酯（色谱纯，CNW）；HLB Prime固相萃取柱（150 mg，3 mL，Waters），其他试剂为分析纯；所有试验用水为一级水。

1.2 试验条件

1.2.1 液相条件

色谱柱：Xbridge C18柱，2.1 mm×150 mm，3.5 μm；流速0.40 mL/min；进样量10 μL；柱温35℃。流动相：0.1%甲酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脱程序为：0～5.0 min，9%～7.5% A；5.0～10.0 min，7.5～4.5% A；10.0～16.0 min，4.5%～9.0% A。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子源，离子模式（ESI+、ESI-）；多反应监测模式（MRM）；气帘气（CUR）流速35.0 L/min；碰撞气：Medium；喷雾电压（IS）：ESI+：5 500 V；ESI-：-4 500 V；离子源温度550℃；雾化气（GS1）流速55.0 L/min；辅助加热气（GS2）：55.0 L/min。雾化气、气帘气、碰撞气均为高纯氮气，使用前调节各气体流量使质谱灵敏度达到检测要求。定性、定量离子及对应的去簇电压（DP）和碰撞气能量（CE）优化到最佳数值。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

准确称取均质后猪肉、鸡肉2.5 g，鸡蛋1.5 g（精确至0.01 g）试样于50 mL具塞离心管中，加入同位素内标和80%乙腈溶液4.00 mL（含0.2%甲酸），涡旋2 min，超声提取20 min，以转速10 000 r/min离心5 min，将上清液转移至离心管中。残渣重复提取1次，合并上清液。用含有0.2%甲酸的80%乙腈溶液定容至10.0 mL，待净化。

准确移取3.00 mL上清液过Prime HLB固相萃取柱，保持一秒一滴的流速，收集全部流出液，准确吸取2.00 mL流出液，于45℃下氮吹至近干，用0.1%甲酸水∶乙腈（9∶1）1.00 mL定容，过0.22 μm有机滤膜，供LC-MS/MS测定。

1.3.2 标准曲线的制作

混合标准溶液及内标溶液：按照磺胺类、喹诺酮类、β-受体激动剂类、氯霉素类、四环素类、大环内酯类、硝基咪唑类、金刚烷胺类、镇静剂类及内标分组，分别准确称量标准品各10 mg于10 mL容量瓶中，磺胺类、β-受体激动剂类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类、硝基咪唑类、金刚烷胺类、镇静剂类用色谱纯甲醇溶解，喹诺酮类用浓度0.03 mol/L NaOH溶解后甲醇定容至10 mL，配制成1 000 μg/mL的单标准储备液，置于-20℃的冰箱保存。取每种类别储备液1.00 mL于10 mL容量中，以甲醇定容逐级配成100.0，10.0，1.00 μg/mL的标准中间液。

取适量的标准中间液，根据每种兽药组分的响应，磺胺类、喹诺酮类、氯霉素类、β-受体激动剂类、林可霉素、大环内酯类配制成含有0.50～10.00 ng/mL、内标质量浓度为5 ng/mL；硝基咪唑类、抗病毒类、镇静剂类1.0～20.0 ng/mL内标质量浓度为50 ng/mL；四环素类、替米考星5.0～100 ng/mL、内标质量浓度为50 ng/mL的混合标准工作液。分别取猪肉、鸡肉、鸡蛋空白样品，经1.3.1样品前处理后，加入1.00 mL混合标准工作液，制备成基质标准工作溶液，现用现配。

2 结果与分析

2.1 样品前处理

2.1.1 提取溶剂的选择

研究中涉及的化合物种类较多，化学性质差异较大，依据每种兽药组分不同的分子结构和化学性质，分别考查了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、（70%，80%，90%）乙腈水、（0.1%甲酸，0.2%甲酸，0.5%甲酸，1.0%甲酸）80%乙腈水等提取溶剂对44种化合物提取效率的影响。

结果显示，甲醇、乙酸乙酯提取大量的脂肪和磷脂，杂质较多。甲醇对大多数化合物提取效率较低，部分化合物低至10%左右，乙酸乙酯对喹诺酮类提取效率极低，鸡蛋几乎提取不出喹诺酮类药物。乙腈溶解性好、渗透强，沉淀蛋白的同时不会提取很多脂肪[13]，作为提取溶剂的回收率较高。但蛋白质遇到有机溶剂变性，均质容易成团，因此试验加入适量纯水，减少乙腈比例使样品中蛋白质发生缓慢充分的变性。试验采用70%，80%，90%乙腈水进行提取，80%乙腈水整体回收率高10%左右。由于待测物中含碱性基团，甲酸可提供酸性环境，与待测物形成有机盐，进而提高待测物的回收率。试验研究含0.1%，0.2%，0.5%，1.0%甲酸的80%乙腈水溶液对化合物提取效率的影响，结果表明采用80%乙腈水溶液（含0.1%甲酸），化合物回收率均偏低。采用80%乙腈水溶液（含0.2%甲酸）所有的化合物的回收率均在60%～110%。甲酸含量的增高降低磺胺类等碱性化合物的回收率。原因可能在酸性条件下碱性化合物的离子化趋势增大，在高比例有机相中溶解性减弱。因此，综合考虑选取80%乙腈水溶液（含0.2%甲酸）作为提取溶剂。

2.1.2 定容溶剂的选择

在多种兽药残留检测时，定容溶剂与目标物的响应和峰形密切相关，因此需要选择对所有目标物均适合的定容溶剂。试验考查了0.1%甲酸-乙腈（9∶1）水溶液、乙腈、0.1%甲酸水溶液作为定容溶剂时目标物的分离效果。结果表明，采用乙腈和0.1%甲酸溶液溶液作为定容溶剂时，部分目标物色谱峰分离效果较差且溶剂效应明显，回收率偏低甚至个别目标物没有响应，不能满足检测需求。选用0.1%甲酸乙腈（9∶1）作为定容溶剂时所有的目标物色谱峰均能有效分离，得到满意的峰型，且回收率较高。综合考虑采用0.1%甲酸乙腈（9∶1）水溶液作为定容溶剂。

2.2 流动相及色谱柱的选择

流动相及色谱柱对目标物的峰形、灵敏度及分离度也有较大的影响，试验比较了Xbridge C18柱、Waters HSS T3色谱柱分离目标化合物效果。试验初期，采用乙腈和水作为流动相，溶剂效应明显且部分化合物灵敏度不高、重复性差。大多数目标物在酸性条件下稳定，更有利于离子化，因此流动相中的酸能明显改善酸碱化合物的峰形。试验流动相采用乙腈和0.1%甲酸水溶液，Xbridge C18柱、Waters HSS T3 2种色谱柱分离度均可满足质谱检测需要[10]。但是，部分目标化合物在Xbridge C18柱上的分离效果和峰形明显优于Waters HSS T3色谱柱，综合考虑，最终选取0.1%甲酸水和乙腈作为流动相、Xbridge C18柱为色谱柱进行分离。

2.3 质谱条件

试验采用三重四极杆质谱，分别进行电喷雾正离子（ESI+）和负离子（ESI-）全扫描模式，采用0.10 μg/mL混合标准工作溶液经针泵注射进样，得到每种化合物响应最佳的准分子离子峰，分别为[M+H]+、[M-H]-。以准分子离子峰为母离子进行二级质谱扫描，产生不同质荷比（m/z）的碎片离子。选择干扰最少、强度较高的2个碎片离子作为特征子离子，信号最强的为定量离子，其次为定性离子。然后再对得到的二级质谱参数如去簇电压（DP）和碰撞能量（CE）等参数进行优化，使定量离子和定性离子强度达到最大，确定最佳质谱参数。

44种化合物及6种内标定性、定量离子及对应的去簇电压（DP）和碰撞气能量（CE）见表1。

2.4 基质效应

采用LC-MS/MS分析样品，基质效应是影响定量结果准确性的重要因素。基质效应（ME）指在样品测定过程中，基质存在导致目标物响应产生变化的现象。为评价基质效应[10]，分别采用空白基质曲线及相应含量溶剂曲线。在相同的仪器条件下，比较空白基质曲线和溶剂曲线目标化合物的离子强度进而评价基质效应[10]。

结果表明，猪肉的磺胺类除了磺胺嘧啶、磺胺氯哒嗪、甲氧苄啶表现出基质抑制外，其余均为基质增强。猪肉的氯霉素、强力霉素、多西环素为基质增强，其余为基质抑制。鸡肉所有的化合物均为基质抑制。鸡蛋甲硝唑为基质增强，其余均为基质抑制。因此，试验采取基质匹配及添加内标的方法抵消或补偿基质效应，氯霉素、克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、金刚烷胺、金刚乙胺、林可霉素、替米考星采用基质匹配及内标法定量，其余化合物采用基质匹配外标法进行定量，保证试验结果准确可靠。

2.5 工作曲线、线性范围及检出限、定量限的确认

标准曲线采用空白基质配制，以质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到每种化合物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限。

44种化合物的质量浓度范围、检出限、定量限、相关系数见表2。

表2 44种化合物的质量浓度范围、检出限、定量限、相关系数

2.6 准确度和重复性

在空白猪肉、鸡肉、鸡蛋中做加标回收和精密度试验，添加量分别为1倍，2倍，10倍检出限，按上述前处理方法及测定条件进行回收率试验，每个添加水平平行测定6次。结果表明，各化合物基质加标回收率为62.5%～110.0%，相对标准偏差（RSD）均小于15%，证明方法的准确性和重复性良好。

3 结论

建立了一种快速、准确测定畜禽肉及鸡蛋等动物源性食品44种兽药残留超高效液相色谱-质谱法(UPLC-MS-MS)定性定量检测方法。猪肉、鸡肉、鸡蛋中44种兽药的检出限为1.0～10.0 μg/kg，定量限为3.0～30.0 μg/kg。与现行国家标准和行业标准相比，该方法能实现同时分析多种兽药残留，大大缩短了检测周期，具有简单、快速、灵敏、准确高等优点，适用于快速筛查畜禽肉及鸡蛋等动物源性食品多种兽药残留的检测。