精氨酸联合生物活性玻璃对乳牙釉质龋再矿化影响的研究

张 芮，贡 敏，祁建艳，周红艳，刘 茜，王 珏，梅予锋，3

龋病已经被证明是影响儿童最普遍的慢性病之一，影响着全球数百万6岁以下的儿童[1]。目前，全球约有6.21亿患有龋病的儿童未接受治疗[2]。如此高的患病率和未治疗率使得低龄儿童龋的预防和治疗成为公共卫生服务的重点。氟化物被证明可以有效逆转早期龋，促进再矿化的进程[3]。然而对于高龋风险者，氟化物的作用被证明是有限的[4]。因为氟化物在pH<4.5时作用效果有限，并且单纯的氟仍然需要额外的钙、磷等其他离子来协同再矿化。此外，氟化物的应用可能存在一定的氟牙症、氟骨症以及氟中毒[5-6]的风险，因此，6岁以下儿童不推荐使用含氟1 000 mg/kg以上的产品[4]。因此，不少学者把目光聚焦到其他材料上，希望通过使用更健康、更安全的材料来改善氟化物在防龋应用方面的局限性和潜在毒性。

近年来，生物活性玻璃(bioactive glass，BAG)由于其良好的生物相容性被广泛应用于口腔众多领域。与其他钙磷基复合物不同，生物玻璃释放的离子可以直接形成羟基碳酸盐磷灰石层，没有中间阶段的无定型磷酸钙(ACP)相[7]。我们课题组预实验表明6%的生物活性玻璃可以有效再矿化乳牙釉质早期龋。然而其生成的矿化物钙磷比低于正常釉质，提示其再矿化能力的局限。Bijle等发现2%的精氨酸(arginine，Arg)可以有效提高氟化钠的再矿化釉质的效果。精氨酸作为产碱底物，可通过参与口腔内的产碱代谢，调高周围环境pH[8]，被认为是一种很有前景的防龋策略[9]。目前罕见研究报道精氨酸联合生物活性玻璃的再矿化效果。我们选择乳牙为研究对象，利用体外pH循环法探究两者联用对乳牙早期釉质龋的再矿化效果，为安全有效地预防儿童龋病提供新思路。

1 材料与方法

1.1 样本收集

该实验获得了南京医科大学伦理委员会的批准(PJ2021-004-01)。2021年4月收集南京医科大学附属口腔医院儿童口腔科60个拔除的乳切牙，要求牙冠完整，无龋坏、裂纹及釉质发育不全等。低速切割机截除牙根，将牙冠用环氧树脂包埋，仅唇面暴露，用碳化硅纸(800,1 200,2 000目)抛光。将釉质面除开窗区(3 mm×3 mm)以外的部分用抗酸指甲油双层封闭，超声清洗5 min，在4 ℃冰箱保存。

1.2 溶液制备与分组

A组：6%BAG(大清生物，北京)溶液(n=10)；B组：6%BAG+1%Arg(麦克林，上海)溶液(n=10)；C组：6%BAG+2%Arg溶液(n=10)；D组：6%BAG+4%Arg溶液(n=10)；E组：去离子水(DDW)(n=10)；F组：正常组(n=5)；G组：脱矿组(n=5)

1.3 脱矿液及再矿化液的制备

脱矿液：2.2 mmol/L CaCl2、2.2 mmol/L KH2PO4和0.05 mol/L乙酸，调节pH为4.5。再矿化液：1.5 mmol/L CaCl2、0.9 mmol/L NaH2PO4和0.15 mol/L KCl，调节pH值为7.0。

1.4 早期釉质龋的制备

除正常组外，将其余55个样本置于脱矿液中,37 ℃下浸泡48 h。脱矿完成后，超声清洗5 min终止脱矿。

1.5 pH循环

分别在上午09:00和下午18:00进行两次pH循环，共14 d。将样本置于脱矿液10 min后用去离子水冲洗，使用微刷将各实验组溶液均匀地涂布在釉质开窗面，涂布5 min。涂布完成后，流水下冲洗表面，擦干后置于再矿化液中，37 ℃培养箱中以模拟口腔环境。

1.6 再矿化后性能测试

1.6.1 表面显微硬度 除正常组和脱矿组外，各实验组每组分别随机选取5个样本，用维氏显微硬度仪测量脱矿前后及再矿化后的显微硬度值，分别记为VHN0、VHN1、VHN2。载荷为0.49 N, 作用时间为10 s，每个样本测量5个点，取均值。硬度恢复率的定义如下：硬度恢复率(REMH) =(VHN2-VHN1)÷(VHN0-VHN1)×100%。

1.6.2 釉质表面微观形貌及元素组成 正常组、脱矿组以及各个实验组每组选取5个样本，乙醇梯度脱水，室温干燥，喷金，使用扫描电镜观察牙釉质表面形貌。每个样本随机选取3个区域进行能谱分析，以定量研究各组钙、磷质量分数以及钙/磷的原子比(Ca/P)。

1.7 统计学方法

用SPSS 25.0统计处理。硬度值及硬度恢复率使用单因素方差分析和图基事后多重检验。钙、磷质量分数，Ca/P使用Welch方差分析和Games-Howell检验两两比较，统计显著性水平设为α= 0.05。

2 结 果

2.1 表面硬度

在基线(P=0.993)和脱矿48 h后(P=0.592)，各组间的硬度值无明显差别。再矿化14 d后，精氨酸与生物活性玻璃联用组的硬度值均显著高于单独应用组，其中C组硬度值最高。各组硬度恢复率均为正值，但各组间差异显著(P<0.001)。各实验组的硬度恢复程度均显著高于DDW组。联用组组间的硬度恢复率无明显差异，均显著高于A组，其中C组的硬度恢复率最高，为67.00%±2.03%，见表1。

表1 各组硬度值及硬度恢复率的均数±标准差

2.2 扫描电镜结果

单一应用组及协同组均形成了新的片状钙化层，层层覆盖，恢复了釉质表面的完整性。C组及D组釉质表面最为平坦，沉积物致密完整，未见明显孔隙。去离子水组可见脱矿后暴露的釉质，部分区域形成了少许沉积物，沉积物较薄且分布不均，见图1。

a：6%BAG；b：6%BAG+1%Arg；c：6%BAG+2%Arg；d：6%BAG+4%Arg；e:DDW组；f:正常组；g：脱矿组

2.3 元素分析结果

脱矿后钙和磷含量均显著降低。 pH循环后，各组钙、磷含量均显著增加,E组增加幅度最低。精氨酸联用组的钙、磷沉积量均显著高于单独应用组，其中D组钙、磷含量最高。脱矿后钙磷比降低为1.50±0.03，再矿化处理后，单独应用生物活性玻璃组的钙磷比升高，但与正常釉质的钙磷比仍有差距。协同应用精氨酸后，钙磷原子比显著上升，且C组及D组的钙磷比与正常釉质相似,见表2。

表2 钙、磷元素的质量百分比和钙磷原子比

3 讨 论

显微硬度已被证明是评估牙齿硬组织变化的有效方法之一，它可以提供釉质表面物理特性的信息[10]。显微硬度的变化与牙齿结构中的矿物成分的变化相关[11]。乳牙釉质中的无机物含量低于恒牙釉质，因此乳牙釉质的表面硬度稍低于恒牙釉质。我们的研究显示，正常乳牙釉质的表面显微硬度为330.48±8.78至333.12±9.05，该数值与Molla Asadollah等[12]的研究结果一致。本研究中，pH循环结束后各组的表面硬度值均升高，表明各组均发生了一定程度的再矿化。添加精氨酸后，显著提高了釉质表面性能的恢复能力，其中添加2%精氨酸的效果最佳。Yesilyurt等[11]也发现，精氨酸与碳酸钙的产品可以显著提高牙齿表面的硬度值，提出主要归因于精氨酸作为碱性氨基酸，可以进一步提高牙齿周围环境的pH值，从而较快达到促进钙磷离子沉积的环境。

生物活性玻璃处理后的表面可以观察到大量的纳米微球，彼此连接成片状，覆盖病变表面。添加精氨酸后，孔隙继续减少，提示可能吸附了更多的离子沉积，能谱分析结果进一步证明了这一点。与单独应用生物活性玻璃相比，加入不同浓度的精氨酸后，钙和磷离子的含量均有显著提升，提示精氨酸具备更好的吸附钙磷离子沉积的能力。精氨酸作为唾液黏蛋白的一种成分，能够有效粘附在牙齿表面，进而调节离子间的动态平衡[13]。此外，精氨酸同时暴露羧基和氨基侧链，静电吸引周围的钙、磷离子。另一方面，精氨酸还可以通过化学键的作用形成高稳定系数的精氨酸-钙-磷复合物[14]。

牙釉质的主要成分为羟基磷灰石，也可能存在杂质(如碳酸盐)，这些杂质从一定程度上降低了钙磷比[15]，本实验收集的正常无龋坏的乳牙釉质表面的钙磷比为1.60，低于理论值1.67。6%生物活性玻璃对病变表面成分的钙磷比恢复有限，添加精氨酸后，显著提高了釉质表面的钙磷比，其中添加了2%及4%精氨酸后，钙磷比与正常釉质无异。Tavafoghi等体外研究表明精氨酸有促羟基磷灰石(HA)成核的能力，可以诱导生成钙磷比为1.80的矿化物[14]，与人体HA相似。钙磷比越高，抗酸能力越强[16]。因此，将精氨酸加入生物活性玻璃中对乳牙龋病防治是有意义的。

我们的研究证明了精氨酸与生物活性玻璃对乳牙釉质早期龋有协同再矿化的效果。形成了钙磷比接近于正常釉质的类羟基磷灰石的钙化物，并恢复了表面硬度和形貌。其中添加了2%精氨酸的生物活性玻璃，综合再矿化性能最佳。精氨酸作为一种营养物质，对儿童较为安全[17]，因此在乳牙早期龋的防治方面有着优越的前景。