基于网络药理学研究八味獐牙菜丸治疗胆囊炎的作用机制

马腾飞，武慧超，陈 蔚，刘媛媛，仁青东主，张金魁，任小巧

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.青海大学，青海 西宁 810016；3.青海藏医药研究院，青海 西宁 810000）

胆囊炎（Cholecystitis）是临床常见病，根据发病的缓急分为急性胆囊炎和慢性胆囊炎，近几年发病率逐渐升高。急性胆囊炎是胆囊的急性炎症性病变，主要由胆囊管梗阻、细菌感染、化学性刺激等引起；慢性胆囊炎可因胆囊结石、高脂饮食等引起，也可由急性胆囊炎反复发作、失治导致［1］。藏医认为胆囊炎主要是由于体内三根与七因素之间平衡失调，热邪上攻胆囊所引起。该病在牧区的发病率很高，常因牧民生活饮食不规律、好食辛辣刺激食物、饮酒、劳累、精神刺激、感染等因素引起。初次发病时症状不太明显，长期发展则会变成慢性疾病［2］。

藏药复方八味獐牙菜丸出自于《四部医典》，为藏医传统方药，藏文名“蒂达杰巴”，由獐牙菜、兔耳草、木香、榜嘎、小檗皮、波棱瓜子、角茴香、岩参等8味藏药组成［3］，主要用于治疗胆囊炎、初期黄疸型肝炎，具有清热解毒、消炎止痛的功效［4］。临床报道八味獐牙菜丸治疗胆囊炎疗效显著［5-8］，但其作用机制尚不明确。网络药理学是通过构建和分析“药物-成分-靶点-疾病-通路”的网络来预测中药及其复方活性成分的方法，具有耗时短、成本低、效率高且有定向性等特点，已逐渐成为中药药效物质基础和作用分子机制的研究趋势［9-11］。本研究通过网络药理学来预测治疗的关键靶点与通路，根据网络药理学“多成分-多靶点-多通路”［12］的特点，研究和分析八味獐牙菜丸治疗胆囊炎潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要活性化合物的获取与筛选通过查询CNKI、万方、维普文献数据库结合TCMSP、BAT⁃MAN-TCM、化学专业等数据库收集八味獐牙菜丸各药味活性化合物，再利用PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载候选化合物的SDF格式文件，并转化为标准的Canonical SMILES 格式保存。由于藏药使用和研究人群小，数据库收录药味数量有限，为保障数据准确性，本研究主要通过查询文献获得药味的活性成分。将获取的活性化合物的SDF 格式文件上传至SwissADME（http://www.swissadme.ch/）平台［13］进行筛选，条件为：①肠胃吸收（gatrointestinalabsortion;GIabsortion）为“High”。此为药物可以被胃肠吸收的条件，用于筛选具有较好口服生物利用度的活性化合物；②5种类药性（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）结果中有2 个以上为“Yes”的化合物，即可作为活性化合物。同时满足上述两项条件的活性化合物均可纳入研究。

1.2 活性化合物靶点预测由于SwissTargetPridic⁃tion 预测的靶点直接为规范后靶点，且统一用一个平台预测可保持平台计算方式一致，减小误差，将所有经过SwissADME 筛选后符合条件的分子结构式的SDF 文件，拖入SwissTargetPrediction 绘画区域中打开可预测靶点［14］；设置属性为“Homo sapi⁃ens”，最后选取所有得分＞0 的靶点，去重后整理为靶点集。

1.3 疾病靶点获取在Genecards（https://www.gen⁃ecards.org）、Omim（https://omim.org）数据库检索关键词“cholecystitis”“chronic cholecystitis”“acute chole⁃cystitis”以收集胆囊炎、慢性胆囊炎、急性胆囊炎相关靶点，纳入所有靶点后删去重复值建立cholecysti⁃tis相关靶点集。

1.4 建立药物-靶点-疾病网络将八味獐牙菜丸和胆囊炎靶点取交集并作韦恩图（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得到八味獐牙菜丸治疗胆囊炎的关键潜在靶点。以纳入的成分、治疗疾病以及作用靶点为基础，构建成分-疾病-靶点网络图，导入Cytoscape3.8.0中进行网络图的绘制。

1.5 建立蛋白质相互作用PPI 网络，筛选关键靶点将药物疾病共有靶点输入String 数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl），将生物种类设定为“Homo sapiens”，默认置信度蛋白质参数＞0.4，去除散在靶点后得到蛋白质相互作用网络（protein-protein inter⁃action network，PPI）。然后将获得的PPI 网络代入Cytoscape3.8.0 中进行可视化处理，将节点颜色和大小根据度值调整。

1.6 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析使用R3.6.3软件对八味獐牙菜丸治疗胆囊炎的预测靶点进行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，获得主要功能富集信息和信号通路，绘制柱状图和气泡图。

2 结 果

2.1 八味獐牙菜丸的有效成分和作用靶点由于未在数据库中查询到岩参（Piper pubicatulumC.DC.）的成分及靶点，且目前关于岩参活性成分的相关研究报道极少，故舍去。最后从八味獐牙菜丸中纳入7味研究药物：獐牙菜Swertiaracemosa（Griseb.）Wall.ex C.B.Clarke、兔耳草LagotisbrevitubaMaxim.、木香AucklandiaRadix、榜嘎Aconitumtanguticum（Maxim.）Stapf/Aconitum naviculare（Bruhl.）Stapf、小 檗 皮Ber⁃beriskansuensisSchneid、波棱瓜子Herpetospermumcau⁃digerumWall、角茴香HypecoumerectumLinn.。查询到满足条件的共88 个活性成分，见表1。筛选得出942 个药物基因靶点（仅在TCMSP 数据库中查询到方剂中木香的有效成分，其余均在文献中查询获取）。

表1 八味獐牙菜丸的有效化学成分

2.2 胆囊炎靶点在Genecards、OMIM 数据库中检索去重后共得到胆囊炎相关靶点854个。

2.3 八味獐牙菜丸治疗胆囊炎预测靶基因的PPI网络将八味獐牙菜丸靶点与胆囊炎靶点取交集，作药物-疾病靶点韦恩图，得交集靶点120 个，见图1。120 个靶点基因基于String 数据库进行PPI网络的构建，将生物种类设定为“Homo sapiens”，根据默认值置信度蛋白质参数＞0.4，去除散在靶点，得到PPI 网络。该网络中有120个节点，1 182条边，平均度值为19.7，见图2。将PPI 网络导入Cytoscape3.8.0 进行可视化处理，见图3。节点颜色和大小根据度值调整，节点越大，颜色越深，度值越大；线的粗细，从粗到细表示从大到小。结果显示，筛选出度值大于2 倍平均度值、介数中心性（betweenness centrality，BC）大于平均值的15 个蛋白靶点，分别为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、蛋白激酶B（AKT1）、白细胞介素-6（IL-6）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、表皮生长因子受体（EGFR）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、细胞周期素D1（CCND1）、HRAS蛋白、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、白细胞介素2（IL-2）、酪氨酸激酶受体2（ERBB2）、TLR4 蛋白、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（MTOR），这提示以上靶点在PPI 网络中发挥了重要的关联作用，可能是八味獐牙菜丸治疗胆囊炎的关键作用靶点。如表2所示。

图1 八味獐牙菜丸与胆囊炎靶点韦恩图

图2 预测靶基因构建的PPI网络

图3 PPI网络中的核心基因

表2 关键靶点拓扑参数

（续表1）

2.4 GO 功能富集分析基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析主要包括生物学过程（biological process，BP）、细胞组分（cell component，CC）和分子功能（molecular functions，MF）。利用String 数据库，将校正P值≤0.05的项目进行筛选，总共富集到1 998条生物过程条目，其中168 条与分子功能相关，85 条与细胞组成相关。排名前10见图4、图5。

图4 GO功能富集分析柱状图

图5 GO功能富集气泡图

八味獐牙菜丸治疗胆囊炎的预测靶点基因生物学过程（BP）主要涉及肌肉细胞增殖、细胞对化学应激的反应、对氧化应激的反应、对酒精的反应等。细胞组分（CC）包括膜筏、膜区、质膜筏、神经细胞体、突触后膜的组成和固有部分、液泡腔等，分子功能（MF）涉及到跨膜受体蛋白激酶活性、蛋白质酪氨酸激酶活性、生长因子结合、转化生长因子β 激活的受体活性、丝氨酸肽酶活性、跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶等。

2.5 KEGG 通路富集分析京都基因和基因组百科全 书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路分析，将药物疾病共有靶点进行KEGG 通路富集分析，引用String 数据库，将校正P值≤0.05 的项目进行筛选，总共富集到139 条信号通路，排名前20 见图6、图7。主要涉及PI3K-Akt 信号通路、低氧诱导因子-1（hypoxia-induceibal factor-1，HIF-1）信号通路、FoxO 信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等。

图6 KEGG信号通路分析柱状图

图7 KEGG信号通路分析气泡图

2.6 成分-疾病-靶点网络为了更好地理解成分、疾病以及相应靶点之间的复杂相互作用关系，以纳入的成分、治疗疾病以及作用靶点为基础，构建了成分-疾病-靶点网络图，导入cytoscape 3.8.0 中进行网络图的绘制，见图8。与GAPDH 靶向的化学成分为1-羟基-3，7，8-三甲氧基口山酮、N-methylcorydal⁃dine、大麦芽碱（hordenine）。

图8 成分-靶点-疾病网络

3 讨 论

八味獐牙菜丸是经典的藏药传统复方，其组成的8 种药材均味苦、性寒，藏医临床用于治疗胆囊炎效果显著。经查阅国内外文献发现，八味獐牙菜丸中的多种成分具有抗菌消炎、抗病毒等药理活性，但尚未有研究者从网络药理学角度分析其作用机理，所以本文试图通过网络药理学方法，从其药味成分、靶点、参与生物过程、信号通路等预测其治疗胆囊炎可能的作用机制。

3.1 八味獐牙菜丸主要化学成分药理活性与胆囊炎治疗的相关作用八味獐牙菜丸中主要的化合物包括苯甲酰异叶乌头碱（6-Benzoylheteratisine）、异叶乌头碱、阿替辛、苦木脂素（Picrasmalignan）、1-羟基-3，7，8-三甲氧基酮（1-hydroxy-3，7，8-trime⁃thoxyanthone）、小檗碱等。有研究表明，苯甲酰异叶乌头碱（6-Benzoylheteratisine）、异叶乌头碱和阿替辛属于榜嘎中生物碱类成分［15］，对炎症早期有一定的抑制作用，尤其是对酵母多糖A 和角叉菜胶诱导的炎症抑制效果良好［16］。苦木脂素（Picrasmalignan）属于木脂素类，有研究表明，木脂素具有广泛的药理作用，包括抗病毒、抗肿瘤、抗菌等，还可以提高免疫力［17］。獐牙菜中的1-羟基-3，7，8-三甲氧基酮（1-hydroxy-3，7，8-trimethoxyanthone）为抑制胆囊炎致病菌的主要有效成分，对大肠杆菌、绿脓杆菌、粪链球菌、变形杆菌及鼠伤寒沙门氏菌都有一定抑菌活性［18］。小檗碱对消化系统疾病，如肠道感染、消化性溃疡、慢性胆囊炎效果明显［19］。因此，推测八味獐牙菜丸中的主要化合物具有消炎、抗菌、抗病毒、抗感染作用，与藏医理论以清胆热、消炎为治疗胆囊炎的基本治法相符。

3.2 八味獐牙菜丸核心作用靶点与胆囊炎治疗相关作用根据网络药理学相关理论与方法，本研究对八味獐牙菜丸治疗胆囊炎作用机制进行了预测，根据查询文献获得有效成分90 个和对应靶点942个。根据PPI 网络分析结果显示GAPDH、AKT1、IL-6、VEGFA、EGFR 等可能为八味獐牙菜丸治疗胆囊炎的关键作用靶点。现代研究表明，这些靶点与胆囊炎的发生发展关系密切。如白细胞介素-6（in⁃terleukin-6，IL-6）是细胞因子网络中的重要成分之一，反映了机体对炎症及感染的反应状态，具有参与免疫调节、炎症反应及抗肿瘤等作用［20］。而慢性炎症导致细胞因子IL-6 过度表达，进而诱导胆囊黏膜上皮细胞过度增殖。研究表明，细胞间黏附因子-1（ICAM-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和血管内皮生长因子（VEGF）在参与血管新生重建，调节促进血管新生再生和维持血管内皮完整性的功能，在胆囊炎损伤及修复愈合过程中起到重要的作用［21］。胆囊疾病患者血清及胆汁中的IL-6 水平升高反映了胆囊炎症的反应程度，胆汁中的IL-6 还可能作为胆囊癌的肿瘤标记物应用于临床诊断参考［20］。炎症- EGFR - 黏蛋白分泌异常间有一定关系，在MUC5CA 黏蛋白合成中，炎症介质EGFR 活化发挥着中心调节作用。炎症介质EGFR 促进MUC5AC 表达，进而促进胆囊结石形成，EGFR 与胆囊结石形成有密切关系［22］。此外，EGFR 为Erb B 的重要家族成员，约38.55% 的胆囊癌患者出现过EGFR 过表达［23］。有研究表明抑制EGFR 过度表达能够有效降低胆囊癌细胞的增殖活性，且靶向EGFR 治疗与吉西他滨联用可显著提高化疗药物的抗肿瘤活性［24］。这与本研究预测的KEGG 结果中的诸多癌症相关通路具有一致性。

3.3 八味獐牙菜丸治疗胆囊炎作用机制的相关信号通路KEGG 信号通路的结果显示，八味獐牙菜丸治疗胆囊炎的靶点重要涉及PI3K-Akt、HIF-1、FoxO、MAPK 等信号通路，具有多成分、多靶点协同作用的特点。在《胆囊癌诊断与治疗》2019 版中［25］，胆囊炎为胆囊癌发病相关危险因素中的确定因素。在PPI 分析中，筛选出最关键靶点为GAPDH。GAP⁃DH 又名甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是糖酵解途径中的一种关键酶［26］。恶性肿瘤细胞主要依赖糖酵解供能，PI3K 信号传导通路参与糖酵解的核心过程。PI3K-Akt 信号通路通过抑制细胞凋亡、调控细胞周期等在肿瘤形成的全程及治疗中发挥重要作用［27］。HIF-1 在细胞和生物对缺氧的适应过程中起到中枢调节作用，且在人类病原体相关的炎性癌症中起重要作用，通过使用HIF-1 特异性抑制剂来预防病原感染是可能的［28］。因此HIF-1 与胆囊炎症以及胆囊癌关联密切。MAPK 信号通路在许多疾病和恶行肿瘤中起着至关重要的作用，且在胆囊癌中被过度表达和激活［29］。总之，在KEGG 分析的TOP20通路中，多条通路均与癌症相关，因此预测八味獐牙菜丸具有潜在的抗癌作用，可在后续进一步进行实验分析。

综上所述，本研究应用网络药理学方法研究藏药复方八味獐牙菜丸治疗胆囊炎的潜在分子作用机制，从而探明了作用靶点及信号通路，明确了八味獐牙菜丸通过多种活性成分对多种靶点发挥其治疗胆囊炎的作用机理，为后续研究八味獐牙菜丸的应用提供了方向与思路，但本研究预测出的靶点、通路仍需要进一步的体内外实验进行验证。