转SoSUT5基因甘蔗后代农艺和品质性状的表现

曾许鹏，牛俊奇，2，Mahmood Aamir，陈炯宇，邢永秀，李杨瑞，3

（1.广西大学农学院，广西 南宁 530004；2.玉林师范学院，广西 玉林 537000；3.中国农业科学院甘蔗研究中心/广西农业科学院甘蔗研究所/农业农村部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室/广西甘蔗遗传改良重点实验室，广西 南宁 530007）

0 引言

甘蔗是世界上最主要的糖料作物，我国的食糖总产量中有90%以上是来自蔗糖，而中国食糖总产量中则有60%以上的蔗糖产量来自广西［1-3］。甘蔗新品种是糖业可持续发展的基础，引进、选育甘蔗新品种、开展甘蔗基因克隆及转基因育种是增加甘蔗种质资源和强化种质创新的重要途径。采用传统的甘蔗杂交育种是选育甘蔗优良品种的重要途径，但传统甘蔗杂交育种周期长，人力物力耗费量大。同时，甘蔗是多倍体单子叶植物，遗传背景复杂，杂交育种有时会出现某些性状劣质基因连锁现象。因此，仅通过常规的杂交聚合各种甘蔗优良性状比较困难［4］。转基因技术可对作物部分性状进行定向改良，能避免杂交育种过程出现的大量基因重组问题，可以在很大程度上缩短育种时间，为培育具有优良性状甘蔗品种和高产高糖育种提供了有利手段［5-6］。蔗糖转运蛋白（SUT）负责蔗糖的跨膜运输，在韧皮部介导的源—库蔗糖运输和库器官的蔗糖供给中起着关键作用。在甘蔗叶片韧皮部，蔗糖的装载主要是在质外体中进行，蔗糖在质外体中的介导需要细胞膜的参与［7］，而SUT在植物细胞质膜上转导蔗糖向韧皮部装载的过程中起着非常重要的作用［8-9］。SUT与甘蔗蔗糖代谢密切相关，其编码的蛋白质具有蔗糖转运活性［10］。但是，SoSUT5基因的功能还不清楚，通过转基因并对其甘蔗后代的农艺性状及品质进行分析研究，可能为探讨其功能提供参考依据。SUT在植物生长和发育的过程中对蔗糖的运输和积累起着非常重要的作用。Riesmeier等首次从菠菜中克隆得到了第一个SUT蛋白，并证实了植物体内SUT的存在［11］。目前，已经从不同的甘蔗品种中克隆出了不同的SUT基因ShSUT4［12］、SoSUT1、SoSUT2、SoSUT3和SoUT5［13］，并对基因的相关功能进行了初步研究。相关聚类分析表明，蔗糖转运蛋白分为SUT1、SUT2、SUT3、SUT4和SUT5共5个亚族［14］，不同的蔗糖转运蛋白基因行使着不同的功能，同一蔗糖转运蛋白在不同的部位和不同生长阶段的表达量不同，对植物作用效果也不相同［15］。相关研究表明，将水稻中的OsSUT5转化到马铃薯后，转基因植株的淀粉和产量都比对照高［16］。本课题组牛俊奇首次从甘蔗中克隆获得SoSUT5基因，并通过转SoSUT5酵母的生长特性分析及SoSUT5基因表达与甘蔗糖分相关性分析证明SoSUT5基因能编码有功能的SoSUT5蛋白，并参与植物糖分的积累和代谢调控［10］。B8是巴西推广应用面积较大的糖能兼用甘蔗品种，其田间表现为出苗率高和宿根发株率高，分蘖力强，但蔗糖分相对比ROC22等甘蔗品种低［17］。Manickavasagam等利用农杆菌介导转化法将Bar基因导入甘蔗中，获得抗Basta除草剂甘蔗植株［18］。赵文慧通过农杆菌转化法将SoSUT5基因转入低糖甘蔗品种B8，经抗性筛选和检测获得了转SoSUT5基因各阳性单株（T0代）［19］。王露蓉分析了转SoSUT5基因B8的第一代（T1）株系成熟期甘蔗+1叶叶面积、茎径、株高和蔗茎中部可溶性总糖，发现SoSUT5基因在甘蔗中过表达可在一定程度上促进甘蔗生长，提高蔗茎中部的可溶性总糖含量［20］。本研究于2018年至2019年分别调查了转SoSUT5基因甘蔗株系和非转基因甘蔗在T2和T3的部分农艺性状，测定了他们在T2、T3、T2R1、T2R2时的部分甘蔗品质，从表型上观察甘蔗B8中转入SoSUT5基因后甘蔗在第二代新植蔗（T2）、第三代新植蔗（T3）、第二代第一季宿根蔗（T2R1）和第二代第二季宿根蔗（T2R2）的生长、农艺性状、蔗茎出汁率、蔗汁重力纯度、蔗糖分积累等方面的表现情况，为转基因甘蔗研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为从本课题组T1代转SoSUT5基因甘蔗B8中经检测筛选出性状较好的4个转基因甘蔗株系（L1、L2、L3和L6），对照与转基因甘蔗为同一批次组培苗后代的非转基因野生型（WT）甘蔗B8株系［20］。所使用的肥料为金正大公司生产的控释参混复合肥（N-P2O5-K2O=22-8-12），总养分大于等于42%。

1.2 甘蔗材料种植

试验于2018年3月至2019年12月在广西大学甘蔗资源圃内进行（N22°50′，E108°17′），地处亚热带季风季候，每年的降雨量主要集中在6~8月。试验地为旱地，红壤土，地势平坦，肥力中等，前季作物是甘蔗。对照和各转基因品系甘蔗分别单行种植，同行排列，行长13m，行距1.2m。选择健康的甘蔗，砍成双芽段，经52℃处理4h后，再用50%多菌灵可稀释粉剂800倍液浸种15min后下种。蔗种行双行品字形排列，下种量为80芽/行。甘蔗两侧撒施复合肥（1200kg/hm2）及防治低下害虫农药。覆5~10cm土层盖种，盖上厚度为0.005~0.008mm地膜后喷施“甲·灭·敌草隆”选择性除草剂。第二代新植蔗（T2）于2018年3月15日、第三代新植蔗（T3）于2019年3月17日进行种植。试验分别于2018年6月25日和2019年6月30日进行大培土。T2每行甘蔗于2019年1月30日砍除掉行长为6.5m的甘蔗后及时进行蔗园清理，留作宿根蔗（T2R1）栽培，余下的6.5m甘蔗作为第二代第二次宿根蔗（T2R2）栽培。第二代第一次宿根蔗（T2R1）和第二次宿根蔗（T2R2）于2019年3月20日进行开垄松兜，于4月16日与新植蔗施同量复合肥及农药后进行大培土。

1.3 甘蔗农艺性状和品质的测定

1.3.1 新植蔗出苗数、分蘖苗数、黑穗病苗数调查

试验分别在2018年4月28日和2019年4月30日调查甘蔗的出苗数，在2018年6月11日和2019年6月30日调查甘蔗的分蘖苗数及黑穗病发病苗数，并分别计算出苗率、分蘖率和黑穗病发生率。甘蔗黑穗病发病苗数调查后，对黑穗病株及时套袋砍除清理。出苗率=出苗出土总数/下种总芽数×100%，分蘖率=分蘖苗数/总苗数×100%，分蘖苗数=当期总苗数-主茎苗数，黑穗病发生率=黑穗病苗数/当期总苗数×100%。

1.3.2 茎径、株高、有效茎数调查

于每年甘蔗的成熟期时随机选取15株健康主苗作为观测株进行茎径和株高的调查。

1.3.3 单茎重调查和甘蔗品质的测定

试验分别于每年甘蔗成熟期时进行采样，采样时选择无黑穗病症状和无虫害的健康甘蔗植株，统一砍除掉+6叶所对应蔗茎节的上半部分，取下半部分进行甘蔗品质的测定［21］。每个品系每次随机选取6株称重后，送广西农业科学院甘蔗研究所进行甘蔗品质的测定。T2进行3次甘蔗的单茎重调查和品质 测 定（2018/11/19、2018/12/25、2019/01/26），T3、T2R1和T2R2进行2次甘蔗的单茎重调查和品质测定（2019/11/18、2019/12/11）。

1.4 统计分析

使用Excel 2003软件进行试验数据的整理，运用Spss 20.0软件进行数据统计和单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 T2、T3代新植蔗出苗率、分蘖率及黑穗病发病情况比较

从表1可以看出，转SoSUT5基因甘蔗的出苗率、分蘖率和黑穗病发生率总体均值上与WT出现较大差异，但在T2和T3时趋势相同。转基因甘蔗出苗率均比非转基因甘蔗低；分蘖率除L6比WT低之外，其余的三个转基因甘蔗品系L1、L2和L3均比WT的高；转基因甘蔗的黑穗病发生率明显比非转基因甘蔗高，特别是L6转基因甘蔗品系，其黑穗病发生率是WT的2倍以上。各转基因甘蔗品系，结果能得到重演。综上可见，甘蔗B8中转进SoSUT5基因对甘蔗出苗率、分蘖率及黑穗病发病率等农艺性状影响非常大，不同转基因甘蔗品系表现不同。

表1 转基因甘蔗T2和T3代新植蔗出苗率、分蘖率及黑穗病发病情况

2.2 转基因甘蔗T2和T3代新植蔗的茎径、株高、单茎重、有效茎数产量构成因素

从表2中可以看出，与非转基因甘蔗相比，4个转基因品系甘蔗的茎径在T2和T3时表现相同，总体均值明显小于非转基因甘蔗，差异显著（P＜0.05，下同），其中L6的茎径与非转基因甘蔗的差异最大，相差17.22%；而L1、L2和L3分别与WT相差12.91%、12.44%和13.88%。同样，各转基因甘蔗株系的茎径小于非转基因甘蔗，以L6的最小。转基因甘蔗的株高均值稍低于非转基因甘蔗，但差异并不显著。转基因甘蔗的单茎重比非转基因甘蔗的低，其中L1、L2、L3和L6分别比WT小30.2%、30.1%、28.7%和29.4%。不同转基因甘蔗品系和非转基因甘蔗分别在T2、T3、T2R1和T2R2时的单茎重同样表现为转基因甘蔗小于非转基因甘蔗。总体上，转基因甘蔗的有效茎数比非转基因甘蔗有效茎数多，转基因甘蔗品系L1、L2和L3的有效茎数分别比非转基因甘蔗WT多34.2%、31.7%和26.2%，而L6与WT的差别不大，且T2和T3表现一致。综上可见，甘蔗品种B8中转入SoSUT5基因后会使甘蔗的茎径变小，单茎重降低，有效茎数大多增加，但对甘蔗的株高影响不明显。

表2 转基因甘蔗T2和T3代新植蔗成熟期的茎径、株高、单茎重和有效茎数

2.3 转基因甘蔗T2、T3代新植蔗、T2代第一季宿根蔗及T2代第二季宿根蔗成熟期甘蔗品质比较

甘蔗蔗汁糖分是蔗糖分最重要的决定性因素。由表3可知，总体上在成熟期时相同的转基因甘蔗品系蔗汁糖分有所变化，各转基因甘蔗品系的蔗汁糖分均低于非转基因甘蔗。T2、T3、T2R1和T2R2各转基因甘蔗品系的甘蔗蔗汁糖分总体均值上要比非转基因甘蔗的低5%以上，其中以L1的最低。

表3 成熟期转基因甘蔗的蔗汁蔗糖分

由表4可知，与甘蔗蔗汁蔗糖分类似，非转基因甘蔗的蔗渣蔗糖分总体上要比各转基因甘蔗品系高。不同转基因甘蔗品系的蔗渣蔗糖分有所差别，但L3和L6的比L1和L2的高。

表4 成熟期转基因甘蔗的蔗渣蔗糖分

由表5可知，成熟期甘蔗蔗糖分总体上表现为各转基因甘蔗品系较非转基因甘蔗低，但不同品系蔗糖分降低幅度有所差别。在T2时，非转基因甘蔗WT的甘蔗蔗糖分总体均值比转基因甘蔗品系L1、L2、L3和L6分别高38.9%、40.0%、19.8%和13.7%；在T3时，非转基因甘蔗WT的甘蔗蔗糖分总体均值比转基因甘蔗品系L1、L2、L3和L6分别高35.6%、51.0%、49.5%和43.4%；在T2代宿根蔗，非转基因甘蔗WT的甘蔗蔗糖分总体均值比转基因甘蔗品系L1、L2、L3和L6分别高18.8%、24.0%、14.5%和5.2%；在T2R2时，非转基因甘蔗WT的甘蔗蔗糖分总体均值比转基因甘蔗品系L1、L2、L3和L6分别提高26.9%、27.3%、23.2%和16.0%。

表5 成熟期转基因甘蔗的蔗糖分

从2年的研究数据结果表6来看，各转基因甘蔗品系甘蔗的出汁率除L1在T2代第一季宿根蔗时低于WT外，其余转基因甘蔗品系在不同年份和不同的月份时都比非转基因甘蔗高，说明甘蔗B8中转入SoSUT5基因后甘蔗能增加新植蔗的甘蔗蔗汁含量，与不同转基因品系降低蔗茎的蒲心程度表现一致。

表6 成熟期转基因甘蔗的出汁率

蔗汁重力纯度测定数据结果表7显示，不同年份和不同月份下非转基因甘蔗的蔗汁重力纯度都比各转基因甘蔗品系蔗汁重力纯度高，其中与L1、L2相差较大，而与L3、L6相差较小。

表7 成熟期转基因甘蔗的蔗汁重力纯度

3 讨论

前人已经从甘蔗中克隆获得了SoSUT5基因，并证明了SoSUT5基因参与植物糖分的积累和代谢［10］。通过农杆菌转化法将SoSUT5基因转入甘蔗中，获得了SoSUT5基因阳性甘蔗单株T0［19］；随后又对T1代转SoSUT5基因甘蔗的部分农艺性状和相关生理生化特性进行研究［20］，发现转SoSUT5基因在T1代甘蔗中过表达时一定程度上促进了甘蔗的生长，提高蔗茎的可溶性总糖含量。本研究在这些研究的基础上分别观察其T2、T3、T2R1和T2R2时甘蔗农艺性状、抗病性和品质等各方面的综合表现。试验结果发现甘蔗B8中转入SoSUT5基因的后代性状发生了一系列改变，各转基因甘蔗的出苗率均低于非转基因甘蔗，而分蘖率大多高于对照。出苗率对甘蔗收获时的有效茎数影响很大，是甘蔗蔗茎产量形成的重要基础。前人在对转抗除草剂Bar基因甘蔗试验研究结果发现，各转基因甘蔗株系的出苗率均低于对照植株，部分转基因甘蔗株系的分蘖率高于对照，认为Bar基因的导入影响甘蔗的生长，主要表现在出苗率降低，对其他农艺性状影响较小［22］。本研究所使用的转基因甘蔗原始材料是通过农杆菌转化法将携带有选择标记基因Bar的pUBTC-SoSUT5表达载体整合到甘蔗B8中，很可能受甘蔗中导入Bar的影响。王继华等认为，在甘蔗中导入外源基因容易使甘蔗农艺性状发生改变，甚至会使部分优良性状丧失，影响甘蔗的产量。在本研究中，转基因甘蔗的黑穗病发病率明显比非转基因甘蔗高，转基因甘蔗抗病性减弱［22］。相关研究表明，植物与病原物互作的抗性反应受自身的遗传基础决定［23］，植物抗病与触发特定信号转导通路网相关［24］。在寄主受病原物感染时，细胞表面分子把信号传递至细胞内，并触发一系列生理生化反应，从而改变寄主体内的代谢活动，提高对病原物的抵抗作用［25］。甘蔗遗传背景的复杂性，其抗病性受多基因共同调控，防御机制和能力因不同甘蔗品种而异［26］。本研究中转基因甘蔗抗病性减弱很可能是受到了基因遗传基础发生改变的影响所致。使用携带甘蔗黑穗病菌的蔗种进行种植，在甘蔗生长过程中如果主茎黑穗病发病较晚没有长出黑鞭或不发病，对茎粗的影响很小［27］。本研究中甘蔗B8中转入SoSUT5基因后茎径也发生了变化，转基因甘蔗的茎径均小于对照，这与前人的研究结果类似［22］。

甘蔗的单茎重主要是由茎径、株高和蔗汁含量决定的。在本研究中，转基因甘蔗的单茎重都小于非转基因甘蔗，而转基因甘蔗的出汁率却均比非转基因甘蔗高。可见，在株高相差不大的情况下转基因甘蔗的单茎重小于非转基因甘蔗，这主要受转基因甘蔗的茎径变小的影响。甘蔗单位面积内的有效茎数往往取决于下种量、出苗率和分蘖率，与前期甘蔗的群体质量有很大的关系［28］。甘蔗生长前期的农艺性状质量，会直接影响甘蔗的产量形成。在本研究中，转基因甘蔗的出苗率较非转基因低，但除L6外有效茎数与分蘖率都较非转基因甘蔗高。

在本研究中，转基因甘蔗T2、T3、T2R1和T2R2总体生长状况和甘蔗蔗糖分均显著较非转基因甘蔗表现差，推测SoSUT5基因可能对甘蔗的生长和糖分积累起负调控作用，如果通过基因工程手段敲除该基因，有可能促进甘蔗的生长和糖分积累。

4 结论

甘蔗品种B8导入SoSUT5基因后不同程度上抑制了甘蔗的生长和糖分积累，降低甘蔗蔗糖分、蔗汁蔗糖分、蔗渣蔗糖分和蔗汁重力纯度等，使甘蔗的品质变劣，同时还使甘蔗茎径变小，增加黑穗病发病率，反映其对甘蔗生长和糖分积累可能起负调控作用。