东方蝾螈C-crk 基因的生物信息学分析

孙菲阳

（深圳北理莫斯科大学，广东 深圳 518172）

近年来，蝾螈肢体再生机制研究是再生医学研究的热点，人们发现了大量生物分子参与肢体再生过程。随着基于转录组学、蛋白质组学技术的进步，发现了大量与肢体再生相关的基因，阐明这些基因在肢体再生过程中的作用，将是肢体再生研究的重点。

信号接头蛋白C-crk 参与了受体整合蛋白和酪氨酸激酶等多种分子的信号转导，与肿瘤的发生、发展密切相关，在人体组织中不表达或少量表达，而在乳腺癌等恶性胶质瘤中的C-crk 在mRNA 与蛋白质水平均是高表达。然而目前对蝾螈C-crk 基因的研究十分匮乏，因此本研究拟对东方蝾螈C-crk 基因的基本生物学信息进行分析，为其在生物学等方面的功能提供理论依据。

1 文献综述

随着现代科学的进步，人类在应对受伤的肢体中，从依赖假肢到尝试新方法使肢体再生，并在此基础上开拓了更专业的研究领域。研究发现，哺乳动物的肢体无法持续再生主要是因为在进化过程中已演变出优秀的人体免疫系统和愈合机制，细胞的再生与伤口愈合中都处于相互抵制状态，但蝾螈却具备强大的肢体再生能力。因此，深入地研究蝾螈肢体再生的作用机理，可为人类在再生医学方面指点迷津，使断肢再生成为可能。

C-crk 基因在癌细胞中过度表达，与癌症进展密切相关。但C-crk 基因在肢体再生中是否存在重要作用仍然未知，阻碍了研究。因此，本文拟对东方蝾螈C-crk基因的基本生物学信息进行分析，为蝾螈C-crk 基因的进一步研究提供依据。

1.1 东方蝾螈概述

东方蝾螈 (Cynops orientalis)，也称中国火龙，是国家级珍稀保护动物，属于两栖纲，蝾螈属[1]。主要分布在我国的江苏、浙江、湖北等省份，背部与两侧分别呈现淡黑色，腹部则为橙红色，是有尾的两栖类脊椎动物[2]。

蝾螈肢体再生研究进展：德国科学家发现在蝾螈体内有一种特殊酶能够促进蝾螈肢体再生，科学家猜想，通过人为的合成这种酶，或许可帮助肢体伤残及器官受伤的病人实现再生[3]。蝾螈的肢体结构与人类肢体非常相似，因此阐明蝾螈肢体再生的细胞机制对人类肢体再生具有重要意义。

目前研究揭示，在蝾螈断肢前从肢体肘部游离肢体神经，结果断肢后其肢体不能再生，这是由于阻止了伤口表皮与肢体神经的正常相互作用，从而导致肢体再生失败，也表明肢体神经对蝾螈肢体成功再生至关重要[4]。另外一些研究也揭示，在断肢后人为、机械的去除愈合的伤口表皮，则肢体再生失败，可见伤口表皮对蝾螈肢体成功再生十分重要[5]。

1.2 C-crk 基因的概述

C-crk 是具有多功能的信号传导接头蛋白，是原癌基因 C-crk 编码的产物[6]，crk 蛋白通过mRNA 的选择性剪接，产生从结构上划分的两种蛋白质:v-crk 和 crk i；crkii 和crkl,高度同源的SH2 和SH3 结构域几乎可以构成所有的C-crk 蛋白[7]。在信号分子传递的过程中，C-crk 蛋白本身并不具备酶活性，一般可与上下游的信号分子作用的是SH2、SH3 结构域，进行有序且特异性地信号传导，参加肿瘤细胞的吸附、侵袭和增殖等信号的转导[8]。

C-crk 基因在癌症中的研究进展：C-crk 广泛参与肿瘤细胞的迁移、生长、凋亡等。正常情况下，C-crk在人体中不表达或少量表达。而在乳腺癌、肺癌、卵巢癌等恶性的胶质瘤中C-crk 在mRNA 与蛋白质水平均是高表达[9]。

冯润华等通过检测368例胃癌患者癌组织中的C-crk表达水平发现，C-crk 在胃癌组织中表达明显升高[10]。此外，李建芳等通过生物信息分析及荧光素酶报告系统发现miR-126 特异性靶向调控C-crk 表达参与胃癌的进展[11]。

朱进等研究发现，C-crk 蛋白在患者乳腺癌组织中表达程度明显高于良性乳腺瘤组织[12]。李敏等发现miR-126 可通过超声微泡介导来调节C-crk 表达抑制乳腺癌细胞生长，为乳腺癌的治疗提供了新的措施[13]。李文燕等研究发现C-crk 在卵巢癌细胞高表达可能直接促进卵巢癌细胞的恶性增殖[14]。

2 实验部分

基于前期的转录组测序数据，获得了东方蝾螈Ccrk(coC-crk)的完整CDS 区cDNA 序列，本实验拟对coC-crk 基因的核酸序列、编码蛋白质的基本理化性质等进行分析。

2.1 实验工具

如表1 所示。

表1 软件的名称及功能

2.2 实验方法

1.基于前期转录组的测序结果，获得coC-crk 基因的cDNA 序列。

2.coC-crk 基因的氨基酸序列及核苷酸序列分析：

打开DNAman 软件，选择“File”“new”，将cDNA 序列导入，点击“Sequence”“load sequece”，选择“From Selection”然后点击“protein”，选择“transl ation”，点击选项“Frame1”。

3.coC-crk 基因编码蛋白质结构域分析:

进入NCBI 网页，选择“Domains &Structures”，点击“Conserved Domain Database (CDD)”，选择“CD Search”。

4.coC-crk 基因编码的氨基酸序列的基本理化性质分析：

打开 Protparam 网站，将氨基酸序列导入，选择“Compute parameters”。

5.分析预测coC-crk 蛋白的二、三级结构：

打开SOPMA 网站，从Secondary structure prediction项目栏中选择“SOPMA”，点击“SUBMIT”。

打开Swiss-Model 网站，点击“Start Modelling”，将氨基酸序列导入，点击“Search For Templates”“Build Models”。

6.获得不同物种C-crk 蛋白质的氨基酸序列：

打开NCBI 网站，选择“Protein”，输入C-crk、Search，点击FASTA，选择“Send to”，勾选“Show GI”，点击“Create file”，下载不同物种的氨基酸序列。

7.coC-crk 蛋白与其他物种C-crk 蛋白质氨基酸序列比对分析：

打开DNAman 软件，选择“Sequence”“Alignment”，选择“Multiple Sequence Alignment”，点击“File”，选择“Full Alignment”“Input”点击“NO”，选择“Run in background”和“show progress”，点击“下一步”，选择默认数值，完成操作。

3 实验结果

3.1 coC-crk 基因序列分析

通过DNAman 软件分析发现，coC-crk 完整CDS区基因大小为567 bp，编码188 个氨基酸。

3.2 coC-crk 结构域分析

使用NCBI Conserved Domain 在线软件分析，发现coC-crk 包含两个结构域，分别是SH2 结构域（5-107氨基酸）和SH3 结构域（119-173 氨基酸）。

3.3 coC-crk 的理化性质分析

通过Protparam 分析发现，coC-crk 的分子量为215 09.99 Da，等电点为5.16。

3.4 coC-crk 二级及三级结构预测

分析发现，coC-crk 的β-折叠占6.38%，延伸链占19.68%，α-螺旋占 18.62%，55.32%为无规则卷曲。以2eyy.1A（同原性为81.72%）为模板，对coC-crk 进行同源建模，PyMOL Viewer 显示coC-crk 蛋白质三级结构，结果如图1 所示。

图1 东方蝾螈C-crk 蛋白的三级结构预测

3.5 coC-crk 氨基酸序列比对

利用NCBI 下载不同物种的C-crk 序列，通过DNA man 软件进行多序列比对。发现除Lepeophtheirus_salmonis 和Mytilus_coruscus 外，其余物种C-crk 的SH2结构域氨基酸序列高度保守，本次所选物种的c-crk 蛋白质序列SH3 结构域高度保守。

4 结论

C-crk 是细胞信号传导的重要基因，研究发现在多种恶性肿瘤中C-crk 的mRNA 及其蛋白表达程度很高，表明其与肿瘤发展密切相关。本研究基于前期转录组测序结果获得coC-crk 基因的CDS 区cDNA 序列，通过生物信息学软件对其分析。

本研究采用多种软件对coC-crk 基因CDS 区核酸序列、编码蛋白质的基本理化性质、多序列比对进行分析，阐明了coC-crk 基因的基本生物学信息，为其生物学功能研究提供理论依据。