优化流式细胞仪滤光片配置的探索

张颖

（华东师范大学，上海 200241）

流式细胞仪(Flow Cytometer，FCM)是一种对悬浮液中处于高速且直线流动的单细胞或颗粒，实现高速且单细胞的多参数定量分析或分选的仪器。同时，对单个细胞（颗粒）进行多参数、快速、准确、高精度的分析（选）的功能，已经成为当前先进的细胞（颗粒）定量分析技术。

1 流式细胞仪的工作原理

液流系统、光学检测系统、电子控制系统、数据储存与分析系统构成了流式的分析仪，具有分选功能的流式细胞仪还包括分选系统。在一定的压力下，悬浮的细胞或颗粒进入鞘液，通过动力学聚焦作用居于鞘液流中心，鞘液包裹着细胞或颗粒通过喷嘴中心进入流动室，在流动式的分析点，激光照射到细胞（颗粒）上，发生光的散射、反射、折射；细胞所携带的荧光素被激光激发，发出不同波长的荧光。散射光、不同波长的荧光，通过不同的滤光片分配到光电倍增光检测器（PMT）上，散射光被PMT转化为电信号，荧光则被聚光器收集，PMT将荧光信号对数放大，转化成电信号。散射光信号和荧光信号经放大后，再经过数据化处理输入电脑并储存。分选系统目前是在流式细流动室的出口喷嘴上安装的压电晶片，根据光学信号的反馈使液流束解离出单细胞液滴并带上相应电荷。带电液滴进入一个恒定静电场后发生方向偏转，包含目标细胞的液滴流入收集容器。

2 流式细胞仪的光学系统及滤光片

光学系统是流式细胞仪的核心结构之一，包括光源和信号接收系统。光源是指激光器；流式细胞仪对细胞及微粒的检测是通过对光信号的收集实现的，包括散射光信号和荧光信号的检测。

流式细胞仪的光学系统是由激光器、若干组透镜、小孔和一系列的滤光片等组成。荧光分光系统是由多组滤光片组成，滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号传送到相应的PMT上。滤光片主要有三类：短通滤光片（Shortpass filter）：小于特定波长的光信号通过；长通滤光片（Long-pass filter）：大于特定波长以上的光信号通过。带通滤光片（Band-pass filter）：只允许一定的波段范围内特定波长的光信号通过。不同的滤光片组合可以将不同波长的荧光信号传送到相应的PMT上。

3 流式细胞仪原滤光片配置的局限性及优化的必要性

荧光素光的强度有强弱之分，单荧光素的选择标记的流式抗体一般尽量选择荧光较强的荧光素，只要在仪器的检测范围，受滤光片配置影响较小；多荧光素组合的流式实验在荧光素的选择上优先考虑的是样本表面或者内部各种抗原表达量的不同。表达高的抗原选择较弱荧光素标记的抗体，而表达量低的抗原则要选择强荧光素标记的抗体。但在10种荧光素以上的流式检测设计方案，低表达的检测标记多，仪器原有配置不能满足检测需求。

目前，流式细胞仪配有多个荧光检测器，可以同时检测多种荧光。每个荧光检测器只允许一种特定波长的荧光信号通过并被检测到，因此我们必须选择适当的信号接收器，才能收到最佳信号，仪器的滤光片的配置决定了哪些信号通道可以被检测到。在进行流式的多色分析实验时，如果想得到理想的检测结果，就必须选择最佳的荧光素抗体搭配。在检测过程中，由于仪器出厂时间比较久，滤光片配置根据当时在市场上应用的荧光素种类进行设置，但随着科技的进步，新荧光素不断被开发出来并应用到流式荧光抗体中，仪器老旧的配置使很多新染料得不到应用，影响科学研究的多色检测实验的步伐。

科学研究的多色检测实验，受限于仪器的出厂配置，荧光素的颜色搭配不能达到最佳，就会产生大量的荧光溢漏，必须进行补偿的调节，带来大量的额外工作。为解决上述问题，我们仔细研究了流式细胞仪的配置，探索通过优化滤光片的搭配，使光路系统的配置更加灵活，建立可实现多种荧光素检测且尽可能少补偿调节的配色方案。实现检测多色流式细胞实验的目的。以流式细胞技术平台的BD LSR Fortessa优化405激发光的荧光检测通道为例，出厂仪器配置如图所示1。

在研究光学系统时，我们发现激光接收盘的结构放置滤光片的位置有顶簧，滤光片的架子规格是固定的，这可以保证滤光片插进去的角度不变，流式细胞仪固定的校准光路设计，保证了激光的接收效果。根据光的性质性的理论分析，利用流式细胞仪荧光接受盘的结构设计特点，我们定制滤光片，优化仪器光学系统，根据实际检测工作的需要灵活地组合搭配滤光片。

由图1我们可知，原405激光器的有6个检测器可接受并检测荧光信号，长通570nm和带通586/15nm组合名为Qdot585的通道与长通为535nm带通为540/30nm名为Qdot565的通道，接受荧光信号波段差小，产生的荧光补偿大；而且市场上Qdot585同波段的荧光素抗体应用较少。经市场和用户使用调研，根据实验需求，进行光学系统优化搭配组合滤光片，改善仪器配置，定制750nm长通滤光片和带通为780/60nm的带通滤光片，搭配使用，引入荧光强度较强，与其他荧光通道波段差异大，相互产生溢漏小，且标记抗体多的BV785（6）荧光素所需750～810nm通道取代Qdot585通道。

图1 原仪器405nm激光接受器配置

将定制滤光片750nm的长通滤光片和780/60nm的带通滤光片置于405nm激发光接收器的A位置，如图2所示，根据光的波段从长到短的行走路径和光性质，重新布局各滤光片的分布，如图2所示。在仪器上重新布局滤光片后，需在软件里重新设置新的“Configration”，405nm激光器激发的荧光接受通道布局按图2进行设置。在新的“Configration”下通过质量控制监测后，发现仪器性能各项指标正常通过质控，未因滤光片的重新布局，受到影响。我们进行BV785（6）荧光素的检测，该通道无论是单色BV786荧光素检测，还是多色的染色方案中都可以检测到BV786荧光素抗体标记的细胞亚群，如图3所示。

图2 405nm激光接受器滤光片的新布局

图3 优化的BV786检测通道

4 结语

优化滤光片配置，对其进行灵活的组合，引入新的荧光检测通道，减少了多色检测实验中的荧光补偿，在多色的实验设计及检测过程中节省实验费用和时间成本。我们对流式细胞仪405nm激光器的一个通道的滤光片进行优化的探索，其他检测通道及其他激光器检测通道的滤光片的优化提供了可循的方案，为多色检测在科研的广泛应用贡献了一份力量。