绵羊胚胎移植技术关键步骤优化*

晁旭东，李 军，刘长彬，李守江，谷红伟，王智鹏，郭延华.，倪建宏，王 萌

（1.佛山守仁生物技术有限公司，广东 佛山 528000；2.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所/省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国建重点实验室）

胚胎移植（Embryo Transfer）亦称“借腹怀胎”，即选择优良的种畜，超数排卵后人工授精，在授精后的第6天，采取手术法冲胚，获得桑椹胚、囊胚或扩张囊胚等早期胚胎，移植于相同物种同一生理状态的母畜子宫内，使之妊娠并发育为另一新生命体的过程[1]。胚胎移植技术是试管婴儿、体外受精、转基因、体细胞核移植等的基础性环节。所以，胚胎生物工程技术又被誉为繁殖技术的第二次生物技术革命，其发展历程已有100多年的历程。1890年英国剑桥大学的Heape，在安哥拉兔上取得了胚胎移植的成果，奠定了胚胎移植的生物学基础。随着研究的不断深入，人们不断在超排方案、药品选择和同期发情程序等方面展开研究，并着重在实践中应用[2]。1990年美国胚胎移植普及率为27.5%，种畜为44%，经济效益超过了650亿美元。美国、法国等每年参加测定的青年公牛80%为胚胎移植牛[3]。截止目前，胚胎移植已发展到分割胚、嵌合体、转基因胚、核移植胚、性别鉴定以及制造生物反应器等，胚胎移植研究领域以及在应用实践上的价值巨大[4-9]。

我国胚胎移植技术起步较晚，但发展速度惊人，1974—1994年20年间完成了引进、学习、消化和吸收、到再创新的阶段。1994—2014年间完成了胚胎移植技术由实验室走出来，开始服务于畜牧业生产，胚胎移植技术在种畜养殖场的应用，已经成为畜牧业发展中最具有价值和生机的应用技术之一[10-13]。

本试验对胚胎移植系统工程中供体挑选、FSH超数排卵、冲胚管放置位置和气球大小、子宫角牵出和打孔等关键技术环节进行进一步深入研究，通过对这些关键环节的完善，在胚胎移植的获胚率和移植受胎率上有了明显提升（P＜0.05）。

1 材料与方法

1.1 试验羊的选择与分组

随机选择健康、无繁殖疾病、具有产羔经历、膘情在2.5～3.0分的萨福克肉羊，随机分组。共选择供体母羊86只，受体母羊115只。所选羊只舍饲，自动饮水机饮水。公羊选择本地体质健壮、性欲旺盛、精液质量优良的成年羊，按1∶25的比例做试情公羊。

1.2 试验药品与材料

CIDR栓（燕瑞生物科技有限公司）、FSH（宁波三生药业有限公司）、PMSG（宁波三生药业有限公司）、PGF2a（上海计划生育研究所、宁波三生药业有限公司）、8号冲胚管（进口）；生理盐水、酒精、碘酒、喷壶、套管针、青霉素、新洁尔灭等均为国产；开膣器、输精枪、1 mL注射器、水浴锅、显微镜。

1.3 实施时间及应用地点

于2019年4月至2020年12月在喀什、克拉玛依、和第八师一四五团开展相关试验。

1.4 胚胎采集

采用羊用冲胚管（8号管）从子宫体打孔插入相对应的子宫一侧，然后气球打气，气球打气量一般在3～5 mL为宜，固定好位置后，向子宫内注入PBS液至子宫充满，然后从宫管结合部，迅速插入套管针，将冲胚液引流至培养皿（100 mm），冲胚结束后将培养皿送至实验室捡胚胎，并做胚胎质量鉴定。

1.5 供体羊营养状况

在整个处理期，保持供体羊的饲养水平均衡，切勿更换饲料。在撤栓时颈部肌肉注射维生素ADE液。

1.6 数据处理

用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，经t检验评估不同组之间的差异。

2 结果与分析

2.1 供体羊体况对超排效果和胚胎质量的影响

在同一饲养管理和同一品种的情况下，按照羊体况评分（参照奶牛评分标准），分值为1～5分，当体况评分在2.5～3.0分时，超数排卵效果较4.0分以上效果好，且差异显著（P＜0.05），见表1。

表1 供体羊体况对超数排卵和胚胎质量的影响

2.2 超排药物对获胚数的影响

在本试验中，选择不同的超排药物组合，取得了不一样的超排结果，且两组数据之间差异显著（P＜0.05），100 IU/支组平均获得的胚胎数高于500 IU/支组，见表2。

表2 超排药物组合对获胚胎数的影响

2.3 冲胚管在子宫角内放置位置与获胚数的关系

对冲胚管气球放置在子宫角内的位置对获胚胎数的影响，以及子宫角大弯前段与子宫角大湾段平均获胚胎数的关系进行研究，结果显示，冲胚管气球放置在子宫角大弯前段获胚数优于子宫角大湾段，且差异明显（P＜0.05），见表3。

表3 冲胚管子宫角内不同放置位置对获胚数的影响

2.4 胚胎移植时子宫角打孔出血率与受胎率的关系

胚胎在移植时，需要在子宫角小弯处打孔，前期研究者一般使用回形针打孔，打孔后子宫角打孔部位出血明显，本研究中使用了子宫角打孔器（专利号：ZL 2015 2 0272750.4）打孔，子宫角打孔部位出血现象极显著减少（P＜0.01）。因为出血比例的降低，受胎率显著提高（P＜0.05），见表4。

表4 子宫角不同打孔方式出血率与受胎率

3 讨论

本研究从体况评分、超排方法、冲胚管放置位置和子宫角打孔等方面对绵羊胚胎移植影响因素进行了试验与分析。研究表明，体况评分在2.5～3.0分之间的供体羊获得的可用胚胎数高于评分为4.0分的供体羊，且差异显著（P＜0.05）。不同超排药物组之间也存在显著性差异（P＜0.05）。冲胚管气球在子宫内所在位置对获得胚胎数方面存在显著性差异，本研究对气球放在子宫角大弯处和大湾前所获得的胚胎数进行了对比，从研究数据可以看出，气球放在子宫角大弯前获得的胚胎数多于子宫角大弯处，且差异显著（P＜0.05），除此之外，在对供体进行冲胚操作时，应根据子宫的体积大小、子宫角长短和子宫角粗细等因素来综合判定冲胚管气球所处的位置，只有通过综合判断，恰当放置冲胚管气球位置才能取得较好的冲胚效果。最后，还研究了钝性（曲别针）打孔和打孔器打孔对受胎率的影响，通过分组数据可以看出，采用钝性（曲别针）打孔，子宫角出血率较高，达到83.93%，而采用打孔器打孔，出血率仅为8.41%，差异极显著（P＜0.01）。子宫角打孔出血直接影响移植受胎率，从试验数据可以看出，子宫角打孔器打孔获得受胎率极显著高于钝性（曲别针）打孔（P＜0.01）。