依托咪酯对新生大鼠认知功能的影响及其机制研究*

杨青青，陆强，刘佳

（苏北人民医院 药学部，江苏 扬州225001）

婴幼儿阶段是中枢神经系统发育的高峰期和敏感期，该阶段神经系统可塑性强，易受外界刺激[1]。有研究显示，围生期使用麻醉药物可能产生神经毒性，损伤神经元，进而影响认知功能[2]。依托咪酯是临床围生期患儿手术常用的全身麻醉药[3]。有研究表明，依托咪酯可通过兴奋γ-氨基丁酸受体，抑制神经系统兴奋，产生麻醉效果，但其对中枢神经元的影响及对远期认知功能的影响尚存在争议[4]。另有研究表明，中枢胆碱能系统，尤其是烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor, nAChR）功能与认知功能关系密切[5]。本研究通过观察新生大鼠依托咪酯暴露后的远期认知功能变化，并观察nAChR 功能的变化，为临床研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD 大鼠，48 只，7 d 龄，均为雄性，体质量10～15 g，饲养于扬州大学动物实验中心。实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2017-0007，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2017-0044。

1.2 主要试剂与仪器

依托咪酯注射液（江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H32022379，规格10 ml：20 mg，批号20191022），α7nAChR 激动剂PNU-282987（北京百奥莱博科技有限公司，纯度99.37%，规格10 mg，货号M06398）。兔抗大鼠α7nAChR、乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase,AChE）单抗购自美国Abcam 公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 单抗（北京博生福生物技术有限责任公司，货号IG101），α7nAChR 和AChE 引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。XR-XY1032 Y 型电迷宫（上海欣软信息科技有限公司），3-15 实验室通用型离心机（德国SIGMA 公司），MRX A2000 型酶标仪（韩国K LAB OPTIZEN 公司），ABI 7500 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪（美国Applied Biosystems公司），DYY-6D 型电泳仪（北京六一仪器厂）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及干预 将48 只新生大鼠随机分为3 组：对照组、依托咪酯组、激动剂组，每组16 只。根据药理实验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算等效剂量[6]，对照组、依托咪酯组、激动剂组分别单次腹腔注射生理盐水10 ml/kg、依托咪酯5 mg/kg、依托咪酯5 mg/kg + α7nAChR 激动剂PNU-282987 5 mg/kg。

1.3.2 认知功能行为学测试 麻醉清醒后2 h，各组随机取8 只大鼠进行行为学测试，各组剩余8 只饲养至第4 周再进行行为学测试。在安静、环境温度（24±2）℃条件下开展测试，所有测试由同一实验人员完成。①洞板实验：将新生大鼠放入洞板实验箱（21 cm×21 cm 平台，平台高出台面15 cm，平台均匀分布16 个洞）中央，统计3 min 内探洞次数[7]。②Y 电迷宫实验：将大鼠放入Y 电迷宫，自由活动5 min 适应环境，采用随机不休息法，测试20 次，记录正确反应次数和全天总反应时间[8]。以受电击后从起步区逃至安全区或通电10 s 内直接跑至安全区为正确反应次数；完成20 次测试时所需总反应时间（通电至大鼠第一次逃至灯亮区的时间，包括正确反应和错误反应所需时间）。

1.3.3 海马组织α7nAChR、AChE mRNA 的检测 取完成行为学测试的各组大鼠（麻醉清醒后2 h 和4 周各组8 只），用二氧化碳CO2窒息处死，断头取双侧海马组织，置于-80℃冰箱冷冻保存备用。采用Trizol 法提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行操作，获得cDNA，行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）反应，按照试剂盒说明书设定反应体系。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性25 s，57℃退火45 s，72℃延伸60 s，共38 次循环，扩增至荧光信号阈值所需循环次数，以肌动蛋白（βactin）为内参基因，采用2-△△CT法计算目的基因相对表达量。qRT-PCR 引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 海马组织α7nAChR、AChE 蛋白的检测 各组8 只，取-80℃保存海马组织，冰上匀浆，加入放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay,RIPA）裂解液冰上孵育20 min，12 000 r/min离心10 min，离心半径8 cm，取上清，测定总蛋白含量。取待测蛋白40 μg与等量上样缓冲液混匀，100℃水浴变性，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离[9]，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，加入5%脱脂奶粉室温封闭2 h，用TBST洗涤后加入1∶400稀释一抗，4℃孵育过夜，TBST 再次洗涤，加入1∶2 000 稀释的二抗，37℃孵育1.5 h。采用化学发光法显影，蛋白相对表达量以α7nAChR、AChE与内参β-actin 的灰度值比值表示。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析，进一步组间比较用SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 依托咪酯对新生大鼠认知功能的影响

新生大鼠麻醉清醒后2 h，对照组、依托咪酯组、激动剂组洞板实验探洞次数比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较结果：依托咪酯组少于对照组和激动剂组（P＜0.05）。3 组Y 电迷宫实验中正确反应次数和全天总反应时间比较，经单因素方差分析，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 3组大鼠麻醉清醒后2 h认知功能比较 （n=8，±s）

表2 3组大鼠麻醉清醒后2 h认知功能比较 （n=8，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与依托咪酯组比较，P ＜0.05。

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新生大鼠麻醉清醒后4 周，对照组、依托咪酯组、激动剂组洞板实验探洞次数、Y 电迷宫实验中正确反应次数及全天总反应时间比较，经单因素方差分析，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 3组大鼠麻醉清醒后4周远期认知功能比较（n=8，±s）

表3 3组大鼠麻醉清醒后4周远期认知功能比较（n=8，±s）

组别对照组洞板实验探洞次数17.35±2.26 Y电迷宫实验正确反应次数14.51±3.63全天总反应时间/s 64.94±10.98依托咪酯组激动剂组F 值P 值16.47±3.45 18.52±2.87 0.690 0.513 14.17±3.94 15.20±4.18 0.118 0.889 65.82±9.60 63.49±10.19 0.104 0.902

2.2 依托咪酯对海马组织α7nAChR、AChE mRNA表达的影响

新生大鼠麻醉清醒后2 h，对照组、依托咪酯组、激动剂组海马组织α7nAChR、AChE mRNA 相对表达量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：依托咪酯组海马组织α7nAChR mRNA 相对表达量低于对照组和激动剂组（P＜0.05），AChE mRNA 相对表达量高于对照组和激动剂组（P＜0.05）。新生大鼠麻醉清醒后4 周，3 组α7nAChR、AChE mRNA 相对表达量比较，经单因素方差分析，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 3组大鼠海马组织α7nAChR、AChE mRNA相对表达量比较 （n=8，±s）

表4 3组大鼠海马组织α7nAChR、AChE mRNA相对表达量比较 （n=8，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与依托咪酯组比较，P ＜0.05。

组别对照组α7nAChR mRNA 2 h 1.11±0.11 4周1.15±0.12 AChE mRNA 2 h 0.71±0.09 4周0.92±0.10依托咪酯组激动剂组F 值P 值0.46±0.07①0.87±0.09②117.567 0.000 1.09±0.11 1.13±0.12 0.263 0.771 1.14±0.13①0.88±0.09②41.895 0.000 0.98±0.11 0.91±0.12 1.058 0.365

2.3 依托咪酯对海马组织α7nAChR、AChE 蛋白表达的影响

新生大鼠麻醉清醒后2 h，对照组、依托咪酯组、激动剂组海马组织α7nAChR、AChE 蛋白相对表达量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：依托咪酯组海马组织α7nAChR 蛋白相对表达量低于对照组和激动剂组（P＜0.05），AChE 蛋白相对表达量高于对照组和激动剂组（P＜0.05）。新生大鼠麻醉清醒后4 周，3 组α7nAChR、AChE 蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5和图1。

表5 3组大鼠海马组织α7nAChR、AChE蛋白相对表达量比较 （n=8，±s）

表5 3组大鼠海马组织α7nAChR、AChE蛋白相对表达量比较 （n=8，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与依托咪酯组比较，P ＜0.05。

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图1 3组大鼠海马组织α7nAChR、AChE蛋白的表达

3 讨论

依托咪酯是咪唑类衍生物，属于非巴比妥类短效麻醉药，具有起效快、无明显呼吸抑制、恢复迅速等优点，广泛用于临床麻醉及麻醉诱导[10]。有研究显示，依托咪酯用于胃癌根治术、老年骨折手术的麻醉对认知功能影响较小，同时有利于稳定血流动力学[11-12]。本研究以7 d 龄新生大鼠（相当于人类1 岁内婴幼儿）为研究对象，观察依托咪酯暴露后对认知功能的影响。

本研究发现，麻醉清醒后2 h，依托咪酯组洞板实验探洞次数减少，Y 电迷宫实验中正确反应次数和全天总反应时间无明显变化。麻醉清醒后4 周，依托咪酯组洞板实验探洞次数、Y 电迷宫实验中正确反应次数和全天总反应时间无明显变化，说明依托咪酯暴露可影响一过性影响新生大鼠近期探索能力，对近期学习记忆能力无明显影响。依托咪酯属于咪唑类全身麻醉药，作用时间短，对循环呼吸及血流动力学影响小，在临床中多用于老年患者，尤其是血流动力学不稳定、危重症患者[13]。有研究显示，依托咪酯用于老年患者骨折术中麻醉诱导和维持，血清皮质醇和氧化应激水平得到改善，手术前后认知功能无变化[14]。

此外，本研究中新生大鼠麻醉清醒后2 h，依托咪酯组海马组织α7nAChR mRNA 和蛋白相对表达量降低，AChE mRNA 和蛋白相对表达量升高；麻醉清醒后4 周，α7nAChR、AChE mRNA 和蛋白相对表达量无明显变化，提示依托咪酯暴露可一过性下调α7nAChR，上调AChE 的表达。nAChR 属于配体门控离子通道蛋白，分布于神经元突触及轴突区域，包括神经型和肌肉型，其中神经型nAChR 功能复杂多样，与多种中枢神经系统功能，如随意运动、记忆、情绪等关系密切[15-16]。nAChR 参与机体多种受体功能调节过程，且具有神经保护作用。左红艳等[17]研究发现，微波辐射暴露可导致大鼠认知功能损伤，证实与海马组织中nAChR 代谢紊乱有关。α7nAChR 是nAChR 的亚型之一，高表达于海马和皮层组织中，参与神经递质释放及突触的可塑性调节。近年来研究发现，阿尔茨海默病患者存在α7nAChR 异常低表达、nAChR 代谢紊乱现象，推测与认知功能下降有关[18-19]。本研究采用α7nAChR 激动剂PNU-282987 干预后，新生大鼠麻醉清醒后2 h，与依托咪酯组比较，激动剂组洞板实验探洞次数增加，α7nAChR mRNA 和蛋白相对表达量升高，AChE mRNA 和蛋白相对表达量降低；而麻醉清醒后4 周洞板实验、Y 电迷宫实验及α7nAChR、AChE mRNA 和蛋白相对表达量无明显变化，提示依托咪酯暴露对新生大鼠探索能力的一过性影响，可能是通过抑制海马nAChR 功能实现。

综上所述，新生大鼠咪酯麻醉对近期学习记忆能力和远期认知能力无明显影响，但可一过性影响新生大鼠近期探索能力，可能与抑制海马nAChR 功能有关。在进一步研究中将研究依托咪酯暴露是否能通过其他信号通路对新生大鼠近期探索能力产生影响，为临床使用咪酯麻醉提供理论参考。