微波技术对葡萄酒中酚类和有机酸类的影响

赖钰婷，原江锋，陈卓瑶，龚明贵

(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023)

0 引言

葡萄酒中含有多种人体正常生理代谢所必需的营养物质，使葡萄酒在中国消费量呈直线上升趋势[1]。年轻的葡萄酒，酒液浑浊、稳定性差、口感粗糙、酸涩、香气不协调、淡薄、饮用质量差，优质葡萄酒需要几个月甚至几年的陈酿期来改善葡萄酒的口感，提高酒体的稳定性[2]。陈酿过程使葡萄酒中的活性成分发生进一步的氧化、聚合等反应，从而改善葡萄酒的口感和风味，提高葡萄酒的品质[3]。酚类物质作为葡萄酒的“骨架”成分，是葡萄中重要的次级代谢产物，影响葡萄酒的颜色、香气和口感[4]，在葡萄酒中起着十分重要的作用。葡萄酒在陈酿过程中总酚的含量随着陈酿时间的延长而下降[5]。有机酸类的种类、浓度及构成会影响葡萄酒的酸性特性，进而影响葡萄酒的色、香、味。在陈酿过程中有机酸和醇易发生酯化反应，从而增加葡萄酒的香气，使有机酸总量逐渐下降并趋于稳定[6]。

传统的陈酿技术具有耗时长、成本高、劳动密集以及潜在的微生物污染等缺点[7]，为了克服上述缺点，在较短的陈酿时间内生产出高质量的葡萄酒，可以使用一些人工催陈技术加速葡萄酒的老化，这些技术包括微氧、超声波、微波、高压、电场、伽马射线和纳米金光催化等[8]。微波技术作为一种比较温和的、有前途的人工催陈技术，在葡萄酒、白酒、果酒和米酒等的催陈方面已经受到关注[9]，处理的酒吸收微波能后，酒体系在微波场下存在热效应和非热效应。热效应使酒体系温度升高，推动自发化学平衡反应，加速酒中活性成分的反应速度[10]。非热微波效应使活性极性分子发生能级跃迁而诱导某些聚合反应进行[11]。文献[12]研究发现：微波工艺可以缩短酒的陈酿期、提升酒品质、增加和平衡香气成分、加速酒体酯化。在应用过程中经常被研究者忽略的问题是：微波仪中控温系统是一种负反馈控制，当实际温度达到设定温度时，微波磁控管的输出功率和工作频率都大大降低。在实际操作中，将微波仪上标识的电功率误认为是微波的实际输出功率而进行讨论分析，从而导致试验结果、数据很难重复，且不同研究之间的实验数据很难相互比较。因此，本文建立了密闭微波磁力搅拌温度控制体系(closed magnetic-stirrer and controlled-temperature cooling microwave irradiation, CMCC-MI)[13]，保持连续的微波能输出，保证试验的重复性和试验结果的准确性。

本文以年轻蛇龙珠干红葡萄酒为研究对象，探究不同的微波功率、温度、处理时间和处理方式对葡萄酒中酚类和有机酸类含量的影响。采用分光光度法测定葡萄酒中总酚的变化，采用酸碱滴定法测定葡萄酒中总酸的变化，采用反相高效液相色谱法测定微波处理后葡萄酒中没食子酸、咖啡酸、丁香酸、儿茶素、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和草酸的含量变化，进而分析微波技术对葡萄酒中主要活性成分的影响。探究微波技术对葡萄酒风味变化的具体机制，为应用微波技术对葡萄酒改变酚类和有机酸类含量并改善葡萄酒感官品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛇龙珠干红葡萄酒购于山东烟台威龙葡萄酒股份有限公司(酿造年份为2019年)，酒精含量(体积分数)12.0%。咖啡酸(caffeic acid)、没食子酸(gallic acid)、丁香酸(syringic acid)、儿茶素(catechin)、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷(malvidin-3-O-glucoside，Mv-3-glu)、花青素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside，Cy-3-glu)均为色谱纯(≥98.00%)，购于合肥博美生物科技有限责任公司；草酸(批号101097-201702，质量分数99.1%)、酒石酸(批号190243-202001，质量分数99.5%)、苹果酸(批号190014-201302，质量分数98.5%)、乙酸(批号190079-202002，质量分数99.9%)、柠檬酸(批号111679-201602，质量分数97.0%)均为优级纯，购于中国食品药品检定研究院；Folin-Ciocalteu试剂、碳酸钠、氢氧化钠、盐酸、无水乙醇均为分析纯，购于天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，购于美国默克公司；纯净水购于新乡娃哈哈昌盛饮料有限公司。

1.2 仪器与设备

XH-MC-1型微波合成仪，北京祥鹄科技发展有限公司；DLSB-10L型低温冷却液循环泵，巩义市予华仪器有限责任公司；WT6000S型大扭矩调速型蠕动泵，保定雷弗流体科技有限公司；UV1800PC型紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；1260安捷伦高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)，安捷伦科技有限公司；万分之一天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；pH计，上海奥豪斯仪器有限公司。

1.3 方法

样品微波处理过程。将50 mL处理样品分别放置于CMCC-MI系统的样品瓶中，每组重复3次。以未处理的葡萄酒作为对照组(control)，进行单因素试验。研究功率依次为100 W、200 W和300 W，温度为40 ℃，时间为3 min处理条件下葡萄酒中活性成分的变化；温度依次为30 ℃、40 ℃和50 ℃，功率为100 W，时间为3 min处理条件下葡萄酒中活性成分的变化；时间依次为1 min、3 min和6 min，功率为100 W，温度为40 ℃处理条件下葡萄酒中活性成分的变化；连续处理3 min和6 min，间歇处理3 min和6 min(每隔1 d分别处理1 min和2 min，连续3 d)，功率为100 W，温度为40 ℃处理条件下葡萄酒中活性成分的变化。

采用Folin-酚比色法[14]测定总酚含量(以质量浓度表示，下同)，以没食子酸为对照品。

采用酸碱滴定法测定总酸含量，参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，以酒石酸为当量，计算总酸含量。

酚类流动相的制备。流动相A：1%(体积分数)甲酸的H2O溶液；流动相B：1%(体积分数)甲酸的甲醇溶液，流动相需经过0.45 μm有机滤膜过滤，超声脱气20 min后使用。

酚类标准液的配制。精确称取没食子酸、咖啡酸、丁香酸、儿茶素、Mv-3-glu、Cy-3-glu标准品，分别为25.0 mg、2.6 mg、5.4 mg、2.5 mg、3.2 mg、2.6 mg，用甲醇溶解后于50 mL容量瓶中定容，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得没食子酸、咖啡酸、丁香酸、儿茶素、Mv-3-glu、Cy-3-glu的质量浓度分别为500 μg/mL、52 μg/mL、108 μg/mL、50 μg/mL、64 μg/mL、52 μg/mL的混合对照品溶液Ⅰ。

酚类HPLC运行条件。色谱柱：反向液相色谱柱(安捷伦ZORBAX SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；检测器(Agilent DAD)波长：280 nm；柱温：25 ℃；梯度洗脱程序：0～3 min，0%～2% B；3～18 min，2%～10% B；18～28 min，10%～20% B；28～43 min，20%～30% B；43～63 min，30%～70% B；63～64 min，70%～100% B；64～69 min，100%～100% B；69～74 min，100%～2% B。

有机酸流动相的制备。精确称取2.399 2 g NaH2PO4，加入纯净水，于1 L容量瓶中定容(浓度为0.02 mol/L)，用H3PO4调节pH至2.70，经0.45 μm水相滤膜过滤，超声脱气20 min后使用。

有机酸标准液的配制。精密取酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、草酸标准品，分别为40.0 mg、50.0 mg、160 μL、60.0 mg、880 μL、1.2 mg，用0.02 mol/L NaH2PO4(pH 2.70)溶解后，于20 mL容量瓶中定容，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、草酸质量浓度分别为2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、9.6 mg/mL、3.0 mg/mL、46.2 mg/mL、0.06 mg/mL的混合对照品溶液Ⅱ。

有机酸HPLC运行条件。色谱柱：反向液相色谱柱(TSKgel ODS-100 V，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：0.5 mL/min；进样量：10 μL；检测器(Agilent DAD)波长：220 nm；柱温：40 ℃。

1.4 数据处理

以上所有试验均重复3次，使用SPSS 23.0、Origin 2018软件进行数据处理和绘图。

2 结果与分析

分别精密吸取混合对照品溶液Ⅰ0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL和5.00 mL，用甲醇分别定容于10 mL容量瓶中，按酚类物质的色谱条件检测，以对照品的峰面积为纵坐标(y)，进样质量浓度为横坐标(x)，得到线性回归方程表(见表1)。分别精密吸取混合对照品溶液Ⅱ0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.60 mL和3.20 mL，用0.02 mol/L NaH2PO4(pH 2.70)分别定容于20 mL容量瓶中，按有机酸的色谱条件检测，以对照品峰面积为纵坐标(y)，进样质量浓度为横坐标(x)，得到线性回归方程表(见表1)。

表1 12种标准品的标准曲线、相关系数、线性范围、检出限和定量限

2.1 微波处理对葡萄酒中酚类物质含量的影响

没食子酸、咖啡酸、丁香酸、儿茶素、Cy-3-glu、Mv-3-glu的标准品和葡萄酒的HPLC色谱图如图1所示，说明上述色谱条件下红酒中主要酚类化合物的色谱峰与其他成分分离良好；标准曲线方程、相关系数、检出限和定量限见表1，说明葡萄酒中的主要酚类化合物在线性范围内与积分面积呈良好的线性关系。葡萄酒中总酚标准曲线回归方程为y=13.095x+0.004，R2=0.986 3。图2为不同微波条件对葡萄酒中酚类物质的影响。由图2可知：在年轻葡萄酒中没食子酸相比较其他5种酚类化合物含量最高。与未处理的葡萄酒相比，不同微波功率、温度、时间和处理方式处理葡萄酒后，没食子酸、咖啡酸、Mv-3-glu的含量都有升高的趋势，总酚和儿茶素的含量呈现降低趋势，Cy-3-glu、丁香酸的含量变化不大。

图1 6种酚类标准品和葡萄酒的HPLC色谱图

(a) 不同微波功率处理

葡萄酒中酚类物质是一大类复杂的具有抗氧化能力的化合物，影响葡萄酒的味道、骨架、结构和颜色等特性，对葡萄酒品质具有重要影响[15]。一般情况下，随着葡萄酒酒龄的增大，由于其氧化程度升高，导致葡萄酒中总酚含量下降[5]。从不同微波条件处理葡萄酒中总酚的结果来看，随着微波温度的升高和微波时间的延长，葡萄酒中的总酚有降低的趋势，这与自然陈酿的条件下总酚含量变化趋势一致。由于较高的温度可能会引起葡萄酒口感较大的改变，因此适宜采用温和的温度来催陈葡萄酒。低微波功率使葡萄酒中的总酚含量降低，但是300 W处理的葡萄酒中总酚有增高的趋势，可能的原因是高微波功率产生较强的高频电磁场，导致葡萄酒中的极性分子产生运动并相互摩擦增强，从而导致分子间化学键断裂，可能造成含酚基团的数目增多，由于Folin-酚比色法测定的原理是氧化还原反应，从而测定的总酚含量有增高趋势，因此采用较低的微波功率产生的高频电磁场更能与自然陈酿的葡萄酒总酚变化趋势一致。从微波处理方式来看，长时间比短时间处理葡萄酒中总酚含量要低，并且间歇处理与连续处理在长时间处理条件下总酚含量差异不大。因此，从葡萄酒总酚含量的变化来看，微波技术采用低功率、较长时间、温和温度来处理年轻葡萄酒，可使葡萄酒中总酚含量变化趋势快速与自然陈酿葡萄酒中总酚含量变化趋势一致。

没食子酸属于水解单宁，没食子酸的浓度和聚合度影响葡萄酒的涩味和苦味，苦涩味对于葡萄酒的独特口感起到关键作用。葡萄酒的涩味与没食子酸的浓度呈正相关，葡萄酒在贮存期间没食子酸的含量有上升趋势[16]，这可能是由于没食子酸是很多酚类物质的组成基础，葡萄酒在贮存过程中一些聚合酚类化合物由于发生水解导致其含量上升。由图2可知：在不同的微波功率、时间、温度和处理方式条件下，葡萄酒中没食子酸的含量均高于未处理的葡萄酒中没食子酸的含量。从整体上来看，功率为100 W、温度为40 ℃、处理1 min后，葡萄酒中没食子酸的含量最高，也就是说在此条件下微波技术能达到较好的催陈效果，并且葡萄酒的口感更好。

儿茶素是一种无色的黄烷-3-醇类化合物，是葡萄酒中含量较丰富的单体化合物，被认为是红葡萄酒中重要的涩感物质。在自然陈酿过程中，葡萄酒中的无色儿茶素发生氧化、聚合，或者儿茶素作为辅色物质，因此造成儿茶素含量呈现下降趋势[17]。儿茶素含量的降低，说明陈酿过程中葡萄酒涩感改变和色泽趋于稳定。从图2可以看出：不同的微波功率、温度、时间和处理方式下的葡萄酒与未处理葡萄酒相比，儿茶素含量呈现出降低趋势，从儿茶素的含量变化来看，微波技术具有与自然陈酿过程相同的变化趋势，说明微波技术具有快速催陈的能力。在100 W、40 ℃、间歇处理6 min条件下，儿茶素含量最低，说明低功率、较低温度和间歇处理方式有利于葡萄酒的催陈。

咖啡酸作为重要的辅色素因子，在葡萄酒陈酿过中，咖啡酸可与花色苷结合形成结构更加稳定的花色苷聚合物，从而提高花色苷的色度。葡萄酒在自然陈酿过程中，咖啡酸的浓度有升高的趋势[16]，这是由于葡萄酒陈酿期间相应咖啡酸聚合物的水解作用造成的。由图2可知：与未处理的葡萄酒相比，在不同的微波条件下其含量均高于未处理葡萄酒，可能是由于微波产生的能量加速了葡萄酒陈酿期间相应聚合物的水解作用。随着微波功率增高、温度升高和处理时间延长，咖啡酸含量趋于稳定，说明不同微波处理条件不会引起咖啡酸含量的较大变化。咖啡酸含量的升高与自然陈酿过程中咖啡酸含量变化趋势一致，由于咖啡酸具有极强的辅色效应[18]，因此可以间接反映微波处理葡萄酒使葡萄酒的颜色趋于稳定，从而证明微波技术可以快速催陈葡萄酒。

花色苷是葡萄酒的呈色物质，其种类、状态和含量在一定程度上决定了葡萄酒的色泽特征和陈酿潜能。由图2可知：Cy-3-glu的含量受微波条件变化影响不大，说明微波技术对于Cy-3-glu结构的稳定不会造成较大影响。不同的微波功率、温度、时间和处理方式条件下，极性的活性组分在微波场中旋转并相互摩擦，在可逆加成断裂链转移聚合(reversible addition fragmentation chain-transfer polymerization, RAFT)过程中，极性的活性成分发生氢键断裂；由于微波辐射也具有合成功能，可能在断裂的氢键上重新合成活性成分[13]。葡萄酒中Mv-3-glu的含量略有升高的趋势，这可能是由于在微波场的作用下葡萄酒中Mv-3-glu聚合物降解作用大于聚合作用，因此造成单体Mv-3-glu形成，从而使Mv-3-glu含量略微升高；并且Mv-3-glu含量在连续处理方式下高于间歇处理方式，可能是由于连续微波处理使Mv-3-glu聚合物降解作用更强，从而引起Mv-3-glu含量的积累。今后进一步探究微波技术对花色苷稳定性的影响，可为微波技术对葡萄酒颜色稳定性提供一定的理论依据。

丁香酸是葡萄酒中较有效的辅色素物质，对于提高葡萄酒颜色的稳定性具有一定的作用[19]。在葡萄酒的自然陈酿过程中，丁香酸是Mv-3-glu的一种降解产物。由图2可知：不同的微波条件下，丁香酸含量变化不大。在葡萄酒贮存过程中Mv-3-glu主要以结合态及聚合态形式存在，由丁香酸稳定的含量说明微波技术没有引起丁香酸-Mv-3-glu聚合物的降解，这样葡萄酒具有更加稳定的颜色，说明微波技术有利于葡萄酒的熟化物质。

2.2 微波处理对葡萄酒中有机酸类物质含量的影响

总酸是评定葡萄酒感官质量的重要指标，适当的总酸含量有助于葡萄酒的长期贮存。葡萄酒的酸度主要由有机酸决定，有机酸含量过高会使葡萄酒有酸涩感、酒味粗硬、品质下降[20]。采用酸碱滴定法测定葡萄酒中的总酸含量，结果发现不同微波条件下葡萄酒的总酸含量呈下降的趋势，尤其是在微波功率为100 W、温度为40 ℃、间歇处理6 min的条件下，总酸含量降低了13.72%。总酸含量的降低可能是由于葡萄酒吸收微波能后，分子的内能增加，化学反应过程加速，加速了醇→醛→酸→酯的转化，从而加速了葡萄酒内部的氧化和酯化反应，因此加速了葡萄酒的陈酿过程。从葡萄酒中总酸的含量来看，低功率、低温、间歇处理有利于控制有机酸的生成。

葡萄酒中有机酸的种类和浓度调节着葡萄酒的酸碱平衡，其中酒石酸、苹果酸、柠檬酸和草酸来自用于酿酒的葡萄浆果、乳酸和乙酸，是酿酒过程中的主要副产品[21]。6种有机酸的标准品和葡萄酒的HPLC色谱图如图3所示。由图3可知：上述色谱条件下红酒中主要有机酸化合物的色谱峰与其他成分分离良好。标准曲线方程、相关系数、检出限、定量限如表1所示，说明葡萄酒中的主要有机酸化合物在线性范围内与积分面积成良好的线性关系。不同微波条件下葡萄酒中酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、草酸的含量变化如图4所示，微波处理葡萄酒中酒石酸、乳酸、草酸的含量基本没有发生变化，而乙酸和柠檬酸含量有降低趋势。苹果酸对于鉴定葡萄酒是否优良有着十分重要的作用，在陈酿过程中苹果酸的含量都比较稳定，但由于部分苹果酸转化成琥珀酸造成含量降低[22]，随着微波功率和时间的增加苹果酸含量呈现出先增加后降低的趋势。根据苹果酸自然陈酿过程中降低的趋势，微波试验参数建议选择200 W、40 ℃、间歇处理6 min，该条件下葡萄酒中苹果酸的含量最低。乙酸是葡萄酒酿造过程的“晴雨表”，其含量的高低直接影响到葡萄酒的品质，而高浓度的乙酸会对葡萄酒的风味产生较大影响，陈酿过程中乙酸和乙醇生成乙酸乙酯，赋予葡萄酒一定的果香味[23]。由图4可知：葡萄酒中乙酸在100 W、40 ℃、处理3 min条件下含量较低，可能是由于微波场下乙酸与乙醇快速合成酯类造成乙酸含量的降低。在葡萄酒的生产中，适量的柠檬酸能改善葡萄酒口感，而柠檬酸的过量使用，却会导致口感不协调，甚至会对人体产生危害。在葡萄酒的酿造过程中，由于柠檬酸发生脱羧反应，因此柠檬酸的含量呈下降趋势。在200 W、40 ℃，间歇处理会较大程度地引起柠檬酸含量的降低，处理符合柠檬酸的自然陈化规律。

图3 6种有机酸类标准品和葡萄酒的HPLC色谱图

(a) 不同微波功率处理

3 结论

(1)通过不同微波功率、时间、温度和处理方式对年轻葡萄酒进行处理，可以看出微波技术可以改变葡萄酒中总酚、酚类化合物、总酸和有机酸化合物的含量，说明微波技术可以改善葡萄酒的理化特性，尤其是风味特性。

(2)通过对微波技术下葡萄酒中总酚和6种酚类化合物含量的影响可知，低功率、40 ℃和间歇处理6 min的条件可以较大程度的增加咖啡酸的浓度，略微升高没食子酸、Mv-3-glu的浓度，降低总酚、儿茶素的浓度，对Cy-3-glu影响不大，而这些物质的变化趋势与自然陈酿葡萄酒中酚类化合物变化趋势基本一致。

(3)通过对不同微波条件下葡萄酒中总酸和6种有机酸类化含物的含量变化来看，微波技术可以改变葡萄酒的酸度，其中对总酸、乙酸、柠檬酸和苹果酸有降低趋势，对酒石酸、乳酸、草酸含量影响不大。这可能是因为微波场加速了有机酸的酯化反应，从而降低了部分有机酸的含量，进而改变葡萄酒的酸性特性。

(4)试验结果有助于了解微波技术改善葡萄酒感官特性的原因，微波技术在一定程度上改善葡萄酒的风味品质，为应用微波技术生产高品质葡萄酒发挥积极作用。至于微波技术对葡萄酒风味品质的影响效果是否具有“返生”现象及是否具有良好的稳定性有待于进一步研究。