鸡Lats1基因在卵泡不同发育期的半定量表达研究

吕智超，李 旭，武 斌，徐日福，张云影*

1.吉林省经济管理干部学院，吉林长春 130000；2.吉林省农业科学院，吉林长春 130033；3.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130118

本实验以150日龄的海兰褐蛋鸡为试验材料，采用半定量RT-PCR方法检测海兰褐蛋鸡不同等级卵泡发育时期Lats1基因的mRNA表达水平，实验结果得出Lats1基因存在于海兰褐蛋鸡卵泡发育各个时期，并呈现一定表达规律，说明Lats1基因参与家禽开产时卵泡发育的调控，有促进细胞生长的作用。本实验为进一步研究Hippo信号通路在鸡卵泡不同发育时期控制细胞增殖时空表达模式打下基础。

1 实验材料

1.1 实验动物

选择150日龄海蓝褐蛋鸡40只，在相同的环境下饲养。在4 ℃低温条件下，快速分离直径为1～3.9 mm、4～4.9 mm、5～5.9 mm、6～6.9 mm、7～8 mm和F6-F1的卵泡组织，放于液氮中速冻保存。

1.2 实验试剂与仪器

微量RNA提取试剂盒(W6221)购自上海华舜公司，TU-1901紫外分光光度计购自北京普析通用仪器有限公司，凝胶成像系统购自上海复日科技有限公司。

1.3 引物的设计与合成

根据GenBank中的鸡Lats1基因mRNA序列（XM_419666.3）和GAPDH基因mRNA序列(K01458)的mRNA为模板，设计半定量实验的引物如表1。所有引物运用Premier 5.0和Oligo 7.0软件设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。

表1 引物设计及扩增产物长度

2 实验方法

2.1 RNA抽提

取新鲜组织100 mg加1 mL TotalRNAExtractor充分研磨，将所得到的RNA溶液一部分用于后续试验，一部分置于-70 ℃保存。

2.2 反转录成cDNA

在0.2 mLPCR管中加4 µL Rnase-free ddH20,1 µL Random Primer p(dN)6（0.2 µg/ µL），70 ℃温浴5 min，冰浴10 sec。利用离心机离心，然后加入下列试剂：1.0 µL Rnase inhibitor（20 U/ µL），2.0 µL dNTP Mix（10 mmol/L），4.0 µL 5×Reaction Buffer，2.0 µL AMV Reverse Transcriptase（10 U/µL）。37 ℃温浴5 min，42 ℃温浴60 min，70 ℃温浴10 min，-20 ℃保存。

2.3 半定量RT-PCR反应步骤

半定量RT-PCR反应体系（25 µL）：RNasefree Water11 µL，2×Tag MasterMix12.5 µL，上游引物0.5 µL，下游引物0.5 µL，cDNA0.5 µL。半定量PCR反应条件：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s（35个循环），终延伸72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

2.4 半定量RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析

Lats1基因与GAPDH基因用2%的琼脂糖凝胶按1:1的比例，130 V恒压电泳30 min。然后利用凝胶成像系统对电泳后的凝胶拍照，凝胶图片会显示Lats1基因与GAPDH基因的灰度值，通过ImageJ2x、BandScan5.0软件进行灰度分析，测三次，求平均值。Lats1基因与GAPDH基因灰度值的比值即Lats1基因mRNA的相对表达量。再通过独立样本T检验和单因素方差（SPSS 18.0软件）对各组数据进行差异显著性分析。

3 半定量RT-PCR实验结果与分析

3.1 电泳检测结果

用游标卡尺将海蓝褐蛋鸡的卵巢按直径大小分为间质、等级前卵泡（1～3.9 mm、4～4.9 mm、5～5.9 mm、6～6.9 mm、7～8 mm）和F1～F6等级卵泡。提取150 d海蓝褐卵巢的12个组织的总RNA，根据目的基因片段的大小配置1.5%浓度的琼脂糖凝胶，将PCR扩增产物与微量溴酚蓝混合，1×TAE电泳缓冲液下，在含有溴化乙啶的琼脂糖凝胶上进行电泳，并通过凝胶电泳成像系统拍照，经观察，能够清楚的看见28 S、18 S和5 S三条带，其中28 S的亮度是18 S的两倍，而5 S是最不亮的。表明提取的总RNA降解少，完整性高。通过核酸蛋白测定仪测定，OD260/OD280值（吸光度值）在1.8～2.2之间，表明此RNA的纯度较高。

3.2 Lats1在海蓝褐组织中的表达情况

定性PCR检测了基因Lats1在海蓝褐蛋鸡肺、卵巢、肾、肝、脾、心、脑和胸腺组织中的表达情况。基因均有表达且表达特异，无引物二聚体和拖尾现象，基因引物特异性强，可用于后续试验。

3.3 Lats1基因mRNA在海兰褐蛋鸡不同等级卵泡中的半定量RT-PCR检测结果

以GAPDH为内标基因，Lats1基因为目的基因。利用半定量RT-PCR检测基因在150日龄海兰褐蛋鸡卵巢间质、1～3.9 mm、4～4.9 mm、5～5.9 mm、6～6.9 mm、7～8 mm、F6、F5、F4、F3、F2和F1共12个卵巢组织中的相对表达量，如表2所示。

从表2看出，在150日龄的海蓝褐蛋鸡各等级卵泡内均检测有Lats1基因表达，但在不同直径大小卵泡中的表达丰度有一定的差异。5～5.9 mm卵泡组织中的表达丰度最高，为0.1970；在6～6.9 mm、F5、4～4.9 mm、F3、7～8 mm和间质的相对表达量次之；在F6的表达水平最低，为0.1045。5～5.9 mm与1～3.9 mm、F4、F6、F1、F2之间差异显著（p＜0.05），6～6.9 mm与1～3.9 mm、F6、F4之间差异显著（p＜0.05），其余的卵泡之间相对表达量差异不显著（p＞0.05）。Lats1基因mRNA在海蓝褐蛋鸡各个等级卵泡中，表达量各不相同，在前等级卵泡中的表达量整体高于等级卵泡的表达量，前等级卵泡中表达量呈先上升后下降的趋势，并在5～6 mm处表达量最高，在等级卵泡中F5表达量最高，F3次之，但整体呈现基本平稳的状态。

表 2 Lats1基因相对表达量

4 讨论

RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是一种常规的、常见的检测基因的方法，它具有较高的灵敏度和特异性。定量PCR对实验仪器和样本处理的要求都比较高，所以结果相对半定量而言会更加精准[1]。但是荧光定量PCR相对成本高，对于一些条件设施不完善的工作平台，选择一种方法，能够替代荧光定量PCR，且结果一致，是有实际利益的。

研究发现，Hippo信号通路是通过调节下游基因的表达，将细胞信号从细胞质传递到细胞核，从而对细胞的生长、增殖和凋亡进行一个整体调控，而且，Hippo信号通路还参与器官大小和组织再生的调控，并在胚胎发育等过程中发挥重要作用。本实验选取的基因Lats1是Hippo信号通路主要基因在家禽的同源基因，为了验证它们是否是家禽体内Hippo信号通路的作用基因，首先我们采用定性PCR方法，验证选取的基因是否存在家禽组织内，再采用半定量RT-PCR方法对基因定量。分析本实验结果显示，Lats1在蛋鸡卵巢组织及各个等级卵泡中均有表达，说明Lats1基因参与了卵泡从开产到产蛋高峰的整个过程，前等级卵泡的整体表达水平略高于等级卵泡的表达水平，在前等级卵泡中表达量先升高后降低，在等级卵泡中，表达量基本稳定，说明Lats1基因参与家禽开产时卵泡发育的调控，也有促进细胞生长的作用。

5 小结

本文根据目的基因Lats1和内参基因在Genebank上已知序列设计引物，对基因进行体系优化及程序优化。主要结果如下：通过定性PCR实验得出：Lats1在海蓝褐蛋鸡肺、卵巢、肾、肝、脾、心、脑和胸腺组织中均有表达且表达特异，无引物二聚体和拖尾现象。基因的引物特异性强，可用于后续试验。说明Lats1基因存在于家禽中大部分的组织器官。

通过半定量RT-PCR实验得出：Lats1在海蓝褐蛋鸡的卵巢间质及各个等级卵泡中均有表达，表达量存在一定规律，前等级卵泡的表达量均大于等级卵泡中的表达量。说明Lats1基因参与家禽开产时卵泡发育的调控，有促进细胞生长的作用。