芳樟醇抑制嗜冷杆菌引起的秘鲁鱿鱼甲醛升高

刘雪飞，马吾霞，李颖畅，李学鹏，蔡友琼，杨贤庆，励建荣*

（1 渤海大学食品科学与工程学院 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心 辽宁锦州 121013 2 中国水产科学研究院东海水产研究所 上海 200090 3 中国水产科学研究院南海水产研究所 广州 510300）

鱿鱼，头足类动物，其肉富含蛋白质，生产和消费均逐年上升[1]。据《中国渔业统计年鉴》数据显示，2018年我国鱿鱼捕捞量达29.2 万t[2]，鱿鱼加工行业年产值达200 亿元，已成为我国水产加工的支柱产业之一[3]。然而，鱿鱼制品中甲醛（Formaldehyde，FA） 含量超标的报道曾一度使鱿鱼市场陷入低谷[4]，并一直是鱿鱼食用安全的关键问题。甲醛，也称蚁醛，35%～40%的甲醛水溶液俗称“福尔马林”，因其可以凝固蛋白质，故具有防腐和杀菌能力[5]。在IARC（International Agency for Research on Cancer，国际癌症研究机构）公布的致癌物清单中，甲醛被放在一类致癌物列表中，世界卫生组织（WHO）还建立了每日0.15 mg/kg 体重的甲醛耐受日摄入量（TDI）[6]。甲醛是国家明令禁止添加到食品中的非食品添加剂[7]，在食品中不得检出，长期食用会严重危害人体健康，具有致癌致畸作用[8]。

内源性甲醛是水产品中甲醛的主要来源，而这些内源性甲醛的产生机理主要有两个途径：生物途径和非酶途径。其中，生物途径是鱿鱼中分解氧化三甲胺（TMAO）的酶和微生物的作用。该酶被称为氧化三甲胺脱甲基酶（Trimethylamine N-oxide Demethylase，TMAOase），广泛存在于海产动物组织中，能催化TMAO 转变为二甲胺（Dimethylamine，DMA）和甲醛[9]。鱿鱼一般采用低温贮藏，这会抑制其中微生物的生长。许多学者对非酶途径和生物酶学途径的研究颇多，而关于微生物对甲醛产生的影响未有报道。有研究表明，在鱿鱼低温贮藏过程中菌落总数与感官评分具有良好的相关性（|r|＞0.9），而嗜冷菌数占菌落总数的95%以上[10]，即嗜冷菌是引起低温贮藏鱿鱼品质下降的优势微生物[11]。低温贮藏鱿鱼中嗜冷菌与甲醛生成的相关性及其控制研究十分重要。

天然芳樟醇气味纯正、清甜,具有令人愉悦的香气，是我国食品添加剂标准中允许使用的香料，且展现出丰富的生物活性，在医疗保健和家庭卫生等领域中具有广泛的应用[12]。林雅慧[13]发现芳樟精油对各种供试呼吸道致病菌均有显著的抗菌作用，且抗菌能力优于山苍籽油、丁香油、迷迭香油、薄荷油等其它植物精油。郑红富等[14]发现芳樟醇的抗菌作用机制是改变菌体细胞膜蛋白的结构，使细胞破裂死亡。此外，芳樟醇对致龋菌具有很好的抗菌活性，可以作为牙膏或者漱口液的成分[15]。

在前期研究过程中本小组从-18 ℃贮藏的秘鲁鱿鱼中分离到1 株近海生嗜冷杆菌L4（Psychrobacter maritimus），该菌能够引起鱿鱼中甲醛含量的显著升高，影响鱿鱼制品的食用安全和品质。本文从抑菌角度控制由嗜冷菌引起的鱿鱼中内源性甲醛的升高及品质劣变，以期提高其贮藏品质和食用安全性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

秘鲁鱿鱼（Dosidicus gigas）购自锦州市林西水产市场，切成大小规格基本一致的鱿鱼块（150 g，12 cm×12 cm）。近海生嗜冷杆菌L4 （P.maritimus）由渤海大学食品安全实验室分离并保存。

芳樟醇（98%），购自上海源叶生物科技有限公司；平板计数琼脂，购自青岛海博生物技术有限公司；2,4-二硝基苯肼（DNPH）、对甲苯磺酰氯，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二水氧化三甲胺，购自上海麦克林生化科技有限公司；三氯化钛、苦味酸、甲苯，购自锦州药业（集团）器化玻有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent HPLC1260 高效液相色谱仪、Agilent GC7890 气相色谱仪，美国安捷伦科技公司；UV-2550 型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；FE20 型pH 计，METTLER TOLEDO 公司；Biofuge Stratos 冷冻高速离心机，美国Thermo Fisher Scientific 公司；GI54DS 高压蒸汽灭菌锅，南京智德丰科学仪器有限公司；MS105UD 电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司；恒温恒湿箱，上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 抑菌剂筛选 查阅文献后选取左旋香芹酮、芳樟醇、乙酸芳樟酯3 种GB 2760 准许使用的植物精油单体物为备选抑菌剂，以体积分数50%的甲醇将精油稀释为不同浓度梯度（2.5，5，10，20 μL/mL），分别加入到活化后的L4 菌液中。同时做只有L4 菌液的空白组和向L4 菌液中加入等量体积分数50%甲醇的对照组，在28 ℃摇床中培养24 h 后测OD595值，确定最佳抑菌剂。

1.3.2 无菌鱼块制备 在铺有保鲜膜的超净台中，将秘鲁鱿鱼块用体积分数75%的酒精浸泡30 s，再用无菌水清洗2 次后在超净工作台内晾干备用[16]。

1.3.3 接种与贮藏 样品分为3 组：空白组、芳樟醇组、L4 组。将L4 活化至菌浓为105CFU/mL 左右[17]，用体积分数50%的甲醇溶解芳樟醇使其质量浓度为5 μL/mL。在超净台中将晾干的秘鲁鱿鱼块充分浸没在L4 菌悬液中，约1 min 后捞出沥干，此为L4 组；芳樟醇组则是将已浸过L4 菌悬液的鱿鱼块再次浸没在芳樟醇溶液中，约1 min 后捞出沥干；空白组样品既不加菌也不加芳樟醇。所有样品分别装入已灭菌的蒸煮袋中，封口并做好标记，移至15 ℃的恒温恒湿箱中贮藏，每隔1 d 定时测样，取样至第10 天。

1.3.4 感官品质 参考雷志方等[18]的方法并稍作修改。挑选8 名经过专业培训的食品院研究生（4男4 女，来自全国不同地区），按照设定标准（表1）对贮藏期间样品的外观、气味、品质进行感官评分，各项最高分为10 分，总计最高分为30 分，结果取总分值的平均值，最后对总评分结果进行综合分析。

表1 感官品质评价标准Table 1 Evaluation criteria of sensory quality

1.3.5 菌落总数 细菌菌落总数测定参照GB 4789.2-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》[19]。

1.3.6 FA 测定 鱿鱼上清液的提取[20]：称取5 g粉碎的鱿鱼肉末至100 mL 具塞三角瓶中，加入40 mL 超纯水，振荡混匀后浸泡10 min，加入10 mL 10% 三氯乙酸（TCA）混匀，冰浴超声30 min，10 000 r/min 离心6 min，取上清液，用1 mol/L NaOH 调至pH=4，然后定容至50 mL。FA 的测定参考Li 等[21]的方法并稍作修改。取5 mL 上清液与2.5 mL 1 mg/mL 2，4-二硝基苯肼衍生剂混匀，60℃水浴30 min，冷水迅速冷却后经0.45 μm 滤膜过滤，然后用高效液相色谱仪进行检测。色谱条件：色 谱 柱：ODS-C18 柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇∶超纯水=70∶30；进样量：20 μL；流速：0.5 mL/min；检测器：紫外检测器；波长：355 nm。

1.3.7 DMA 测定 参考贾佳等[22]的方法并稍作修改。取2 mL 上清液，加入2 mL 65% KOH 溶液，加超纯水定容至5 mL，加入2 mL 对甲苯磺酰氯-甲苯溶液，60 ℃水浴加热60 min，取出冰浴冷却，漩涡振荡3 min，取甲苯层进行GC-FID 分析。

1.3.8 三甲胺（TMA）测定 参考朱军莉等[23]的方法并稍作修改。取4 mL 上清液于25 mL 具塞比色管中，另用4 mL 蒸馏水作为空白对照，每个比色管依次加入1 mL 10% FA、5 mL 甲苯、3 mL 25%KOH，30 ℃水浴20 min，振荡比色管使内容物充分混合，然后将甲苯层用0.2 g 无水硫酸钠吸水，吸取2 mL 无水甲苯层与2 mL 苦味酸混合，在410 nm 处测定吸光值。

1.3.9 TMAO 测定 TiCl3可使TMAO 还原为TMA，通过比色测定TMA 的含量，进而对TMAO进行定量。测定时取4 mL 待测溶液于25 mL 具塞比色管中，另用4 mL 蒸馏水作为空白对照，每个比色管加入1% TiCl3溶液0.5 mL，80 ℃水浴90 s，冷水冷却，以下测定步骤同TMA 测定步骤。

根据以下公式计算TMAO 含量：

X=（A1-A2）×75.11/59.11

式中：X——样品中 TMAO 含量，mg/L；A1——经TiCl3还原后的TMA 含量，mg/L；A2——样品中TMA 含量，mg/L；75.11——TMAO 的分子质量；59.11——TMA 的分子质量。

1.3.10 硫代巴比妥酸值（TBA） 测定 参照GB 5009.181-2016 《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》中的分光光度法，测定样品的TBA 值。称取10 g 绞碎的秘鲁鱿鱼肉末，向其中加入25 mL 蒸馏水，均质后加入25 mL 质量分数5%的三氯乙酸，搅拌均匀，静置30 min，用双层定量慢速滤纸过滤，弃去初滤液，续滤液备用。取5 mL 清液，向其中加入5 mL 0.02 mol/L 的硫代巴比妥酸，混匀，置于80 ℃恒温水浴中加热40 min，然后立刻冷却至室温，在532 nm 波长下测定吸光度。

1.3.11 pH 值 参考杨华等[24]的方法并稍作修改。取10 g 绞碎的秘鲁鱿鱼肉末，加入超纯水100 mL，均质。静置30 min 后过滤，取滤液50 mL用pH 计测其pH 值。

1.3.12 数据分析 每组样品做3 个平行。采用Excel、SPSS 23 及Origin 8.5 进行数据处理、分析和作图。

2 结果与分析

2.1 抑菌剂的确定

由表2数据可知，对照组和空白组无显著差异，因此可认为体积分数50%的甲醇对嗜冷杆菌L4 并无抑菌作用。左旋香芹酮、芳樟醇和乙酸芳樟酯这3 种备选抑菌剂在相同浓度下时，均为芳樟醇的抑菌效果最为显著（P＜0.05）。而芳樟醇在不同浓度下时，以5 μL/mL 时对嗜冷杆菌L4 的抑菌效果最优，故选5 μL/mL 的芳樟醇作为后续试验抑菌剂及使用浓度。

表2 不同抑菌剂对嗜冷杆菌L4 的影响Table 2 Effects of different bacteriostatic agents on P.maritimus L4

2.2 FA、DMA、TMA 和TMAO

从图1可以看出，随着贮藏时间的延长，3 组样品中的FA、DMA 和TMA 含量均呈上升趋势，而TMAO 含量均呈下降趋势。有研究发现鱼肉中细菌数量与TMA 的生成量之间有着密切联系[25]，TMAO 在细菌作用下可在新鲜海鱼体内分解为TMA[26]。本试验结果说明TMAO 逐渐被降解为FA、DMA 和TMA，但不同处理组其降解程度不同。L4 组的FA、DMA 和TMA 含量上升幅度以及TMAO 含量下降幅度均显著大于芳樟醇组和空白组（P＜0.05）。贮藏到第10 天时，L4 组的TMAO 含量降为470.191 mg/kg，与贮藏初始含量（17 078.429 mg/kg）相比，降解率达到了97%。而FA 含量由贮藏初始的0.173 mg/kg 攀升到31.835 mg/kg，增加了约184 倍。同时，DMA 和TMA 含量至第10 天时也分别增加了约11.2 倍和58.9 倍。说明嗜冷杆菌L4 能够迅速降解鱿鱼体内的TMAO 并转化为FA、DMA 和TMA，降低鱿鱼食用安全性。FA、DMA和TMA 含量在第6 天和第8 天时上升幅度最为显著（P＜0.05）。

图1 芳樟醇对秘鲁鱿鱼FA、DMA、TMA 和TMAO 含量的影响Fig.1 Effect of linalool on FA，DMA，TMA and TMAO contents in D.gigas

经芳樟醇处理后，FA、DMA 和TMA 含量显著低于同期L4 组（P＜0.05），降低倍数在1.3～12.2 之间。而TMAO 含量高于L4 组同期指标的1.1～15.9倍。在第10 天时，芳樟醇组的TMAO 含量为4 786.142 mg/kg，是L4 组的10.2 倍，FA 含量为14.837 mg/kg，接近L4 组同期指标（31.835 mg/kg）的1/2。说明芳樟醇能够明显减慢嗜冷杆菌L4 引起的FA 升高，提高秘鲁鱿鱼贮藏期安全。

2.3 感官品质

感官评分在水产品品质评定中占有重要地位，可以直观反映水产品在贮藏过程中的品质变化规律。由图2可知，秘鲁鱿鱼在15 ℃贮藏的过程中各处理组感官评分均呈现降低的趋势。从3组样品感官评分的优劣来看，芳樟醇组＞空白组＞L4 组。其中，L4 组的感官评分随贮藏时间的推移下降最快，在第4 天时鱼块已有明显的臭味出现，感官评分值为22，颜色微变泛黄，略有弹性。而芳樟醇组的鱼块在第8 天时才开始出现明显臭味，感官评分值为20，脂肪黄出现，颜色开始变暗，肉质软化。表明嗜冷杆菌L4 加快了蛋白质水解的进程，导致秘鲁鱿鱼块品质劣变，芳樟醇处理可以较好的保持秘鲁鱿鱼的品质，进而延长其货架期。

图2 芳樟醇对秘鲁鱿鱼感官品质的影响Fig.2 Effect of linalool on sensory quality of D.gigas

2.4 菌落总数

微生物的生长繁殖是导致水产品腐败变质的主要因素，因此菌落总数的变化可以很好的反映水产品的新鲜度，即使采用低温贮藏，嗜冷菌依然可以引起鱿鱼的品质劣变[10]。如图3所示，随着贮藏时间的延长，3 组样品的菌落总数值皆不断增加。L4 组在第2 天时菌落总数值已达到6.2 lg（CFU/g），超过了国家标准限定值6.0 lg（CFU/g），而芳樟醇组在第4 天时才达到限定值，至少比L4组延长2 d 的货架期。空白组由于前期进行了消毒处理故菌数增长较慢，但在实际捕捞后的鱿鱼贮藏过程中不会进行消毒处理，故带菌状态更接近实际情况。芳樟醇组和空白组的菌落总数值一直显著低于L4 组（P＜0.05），说明芳樟醇具有抑菌作用，可以有效抑制秘鲁鱿鱼块中微生物的生长繁殖，保持鱿鱼的鲜度，与林雅慧[13]的结果一致。

图3 芳樟醇对秘鲁鱿鱼菌落总数的影响Fig.3 Effect of linalool on total plate count of D.gigas

2.5 TBA

TBA 含量可作为评价水产品脂质氧化程度的重要指标，通过TBA 与脂质氧化产生的丙二醛发生反应，水浴显色，检测532 nm 波长处的吸光度值判断其脂质氧化程度的大小[27]。有研究表明鱼体脂肪氧化程度与脂肪含量、鱼的种类、贮藏温度等因素有关[28]。秘鲁鱿鱼块在15 ℃贮藏过程中TBA 含量的变化如图4所示，空白组、芳樟醇组和L4 组的TBA 含量整体均表现出先升高再降低的趋势，且空白组和芳樟醇组的TBA 含量显著低于L4 组（P＜0.05）。分析认为，芳樟醇抑制了嗜冷杆菌L4 的大量增殖，降低了微生物对脂肪的利用率，进而使脂肪氧化速度减慢。从第6 天开始，3 组样品的TBA 呈现下降的趋势，这是因为鱿鱼在贮藏后期脂肪氧化产生的丙二醛与鱿鱼体内的氨基酸、核酸、核苷、蛋白质及醛类化合物等成分发生反应[29]，致使TBA 浓度下降。

图4 芳樟醇对秘鲁鱿鱼TBA 含量的影响Fig.4 Effect of linalool on TBA content in D.gigas

2.6 pH 值

pH 值常作为判断水产品品质的重要指标之一，因为pH 值越高越容易污染微生物，引起营养物质的降解，食品腐败得越快[30]。如图5所示，随着贮藏时间的推移，3 组样品的pH 值呈现先降低后升高的趋势。pH 值降低的原因是鱿鱼死亡后体内的糖原经无氧降解，产生乳酸和丙酮酸等酸性物质[31]。从第2 天开始3 组样品的pH 值持续升高，这是由于微生物的生长繁殖使鱿鱼内的蛋白质、氨基酸等含氮物质被降解，产生的氨、三甲胺、吲哚等[32]，使其pH 值上升。在第10 天时L4 组pH值升至8.67±0.02，空白组和芳樟醇组的pH 值分别为7.61±0.01 和8.05±0.01。芳樟醇组的pH 值始终低于L4 组，可能的原因是芳樟醇通过抑制嗜冷杆菌L4 减少了菌体胞外蛋白酶的产量，减缓对鱼肉的分解作用，碱性物质积累量少，进而放慢了pH 值上升速度[33]。

图5 芳樟醇对秘鲁鱿鱼pH 值的影响Fig.5 Effect of linalool on pH of D.gigas

3 结论

试验发现，接种了嗜冷杆菌L4 的秘鲁鱿鱼其FA、DMA 和TMA 含量均显著高于同期空白组（P＜0.05），并且该组鱿鱼块的品质劣变、菌落总数、TBA 值和pH 值也显著高于空白组（P＜0.05）。说明嗜冷杆菌L4 能够促进秘鲁鱿鱼中FA 的产生和品质劣变。而芳樟醇组各项指标均显著优于L4 组（P＜0.05），同时优于或同于空白组，说明芳樟醇具有抑菌性，能够抑制嗜冷杆菌L4 引起的秘鲁鱿鱼的甲醛升高及品质劣变，提高其食用安全性和贮藏品质。但一种试剂作用单一，今后可采用多种生物活性成分复合或结合保藏技术进一步提高鱿鱼的食用安全性。