饲粮中添加凹凸棒土对荷斯坦犊牛生长性能、腹泻率、血清生化指标和肠道菌群的影响

王 栋 杜垣逸 郑 铎 尤振东 刘 云

(东北农业大学动物医学学院，黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室，哈尔滨 150030)

犊牛腹泻发病率高，且容易继发感染呼吸道疾病，是造成犊牛生长迟缓和死亡的主要原因之一，给奶牛养殖造成严重的经济损失[1]。生产上主要使用抗生素防控犊牛腹泻，虽然抗生素可以有效缓解犊牛腹泻，提高犊牛的生长性能，但由于抗生素的耐药性和残留问题越来越受到社会的关注[2]，此外，我国也已经全面停止生产含有促生长类药物饲料添加剂的商品饲料。因此，寻找合适的抗生素替代品便成为当前研究的热点。

凹凸棒土(palygorskite，PAL)，又名坡缕石，是一种硅镁铝酸盐粘土矿物质，广泛存在于自然界，其特有的层状晶体结构赋予其良好的吸附性、离子交换性、流变性、脱色性以及粘性等理化特性[3]。在动物生产上，PAL具有促进动物机体新陈代谢，提高饲料转化率，提高抗氧化能力，改善机体免疫状态和抑制致病菌定植的作用[4]。研究表明，饲粮中添加PAL可以有效地吸附黄曲霉毒素，缓解黄曲霉毒素对仔猪和肉鸡的损伤[5]。Zhang等[6]的研究表明，饲粮中添加2 000 mg/kg的PAL能降低断奶仔猪的断奶应激，改善肠道屏障功能，降低腹泻率，提高生长性能。此外，Qiao等[7]的研究还发现PAL具有调节蛋鸡盲肠微生物菌群的作用。目前，PAL的研究主要集中在猪、肉鸡和蛋鸡，尚缺乏对犊牛的相关研究。因此，本研究以荷斯坦犊牛为研究对象，通过在饲粮中添加PAL研究其对犊牛生长性能、腹泻率、血清生化指标和肠道菌群的影响，为PAL在犊牛生产中的合理应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用PAL中凹凸棒含量≥75%，膨润土含量≤25%，镁含量<4%，水分含量≤18%，粒度为60目。

1.2 试验设计与饲养管理

饲养试验在黑龙江省尚志市现代牧业进行。选取健康的初生犊牛30头，采用单因素完全随机试验设计，随机分为2个组，每个组15个重复，每个重复1头牛。犊牛于出生后2 h内灌服初乳4 L。第2～21天，饲喂常乳，每天2次(08:00、16:30)，每次3 L。第22～31天，饲喂代乳粉，每天2次(08:00、16:30)，每次4.5 L。第32天至断奶，饲喂代乳粉，每天2次(08:00、16:30)，每次5 L。代乳粉主要成分含量：乳糖≥40%，蛋白质≥22%，脂肪≥19%，水分≤4.0%，粗灰分≤8.0%，粗纤维≤0.3%。代乳粉用37 ℃温水稀释(150 g/L)后饲喂。犊牛出生后第3天开始添加开食料，其中对照组饲喂基础饲粮，PAL组饲喂基础饲粮+2 000 mg/kg PAL，自由采食和饮水。基础饲粮组成及营养水平见表1。PAL的使用剂量参考Zhang等[6]的研究结果。试验期63 d，分3个阶段：饲喂牛乳阶段(1～21日龄)，饲喂代乳粉阶段(22～56日龄)和断奶后1周(57～63日龄)。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.3 样品采集与指标检测

1.3.1 生长性能和腹泻率

准确称量犊牛初生体重并在犊牛21、56和63日龄晨饲前空腹称重，计算犊牛的平均日增重(ADG)。试验期间准确记录犊牛的采食量，计算犊牛平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。根据Wen等[8]的方法进行粪便评分(0=坚固，1=黏稠度疏松或适中，2=非常松散或轻度腹泻，3=水样稀便)，粪便评分≥2，连续2 d或以上定义为腹泻，记录犊牛腹泻天数和腹泻头数，计算腹泻率。

腹泻率(%)=[腹泻头数×腹泻天数/
(试验头数×试验天数)]×100。

1.3.2 血清生化指标

犊牛分别于21、56和63日龄晨饲前进行颈静脉采血，离心后制备血清。采用全自动生化仪检测犊牛血清总蛋白(TP)浓度。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法在全自动生化仪上检测检测血清免疫球蛋白[免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)]、炎症因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)]、生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGFs)浓度。犊牛血清抗氧化指标[总超氧化物歧化酶(T-SOD)与谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、总抗氧化能力(T-AOC)以及丙二醛(MDA)浓度]采用分光光度计法测定，试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.3.3 肠道菌群

分别于21、56和63日龄晨饲前无菌采集犊牛直肠粪便，采用实时荧光定量PCR(qPCR)法检测犊牛直肠粪便中菌群的组成，具体操作参考焦金真等[9]的方法。采用TIANamp Stool DNA Kit试剂盒提取直肠粪便总细菌DNA，用ND-1000分析仪检测DNA的浓度和纯度。首先将提取的总细菌DNA分别与不同浓度总细菌、栖瘤胃普雷沃氏菌、大肠杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌和乳酸菌的标准质粒进行qPCR检测，将标准质粒浓度和Ct值做回归分析，绘制标准曲线。然后将样品Ct值带入回归方程计算目标菌属DNA拷贝数，结果用每克内容物中细菌拷贝数的常用对数[lg(拷贝数/g)]表示。PCR所用引物见表2。

表2 微生物的特异性引物序列Table 2 Specific primer sequences for microbes

1.4 数据统计分析

试验数据采用Excel 2010进行整理，采用软件SPSS 20.0的独立样本t检验进行组间试验数据分析，P<0.05时为差异显著，P<0.01时为差异极显著。结果以平均值±标准误(mean±SE)表示。

2 结 果

2.1 饲粮中添加PAL对犊牛生长性能的影响

由表3可知，与对照组相比，饲粮中添加PAL可显著提高1～21日龄犊牛的ADG(P<0.05)，显著增加1～21日龄和57～63日龄犊牛的ADFI(P<0.05)；饲粮中添加PAL增加了22～56日龄和57～63日龄犊牛的ADG，但差异不显著(P>0.05)；在整个试验期间，与对照组相比，饲粮中添加PAL对犊牛的F/G无显著影响(P>0.05)。

表3 饲粮中添加PAL对犊牛生长性能的影响Table 3 Effects of PAL supplementation on growth performance of calves

2.2 饲粮中添加PAL对犊牛粪便评分和腹泻率的影响

由表4可知，与对照组相比，饲粮中添加PAL可显著降低1～21日龄和57～63日龄犊牛的粪便评分(P<0.05)，对22～56日龄犊牛的粪便评分无显著影响(P>0.05)；饲粮中添加PAL在不同阶段均降低了犊牛的腹泻率，其中1～21日龄和57～63日龄犊牛的腹泻率显著低于对照组(P<0.05)。

表4 饲粮中添加PAL对犊牛粪便评分和腹泻率的影响Table 4 Effects of PAL supplementation on fecal score and diarrhea incidence of calves

2.3 饲粮中添加PAL对犊牛血清TP、GH、IGFs以及免疫球蛋白浓度的影响

由表5可知，与对照组相比，饲粮中添加PAL对各日龄犊牛血清TP、GH、IGFs的浓度均无显著影响(P>0.05)。与对照组相比，饲粮中添加PAL显著增加了21日龄犊牛血清IgA、IgM以及56日龄犊牛血清IgG和63日龄犊牛血清IgA的浓度(P<0.05)。

表5 饲粮中添加PAL对犊牛血清TP、GH、IGFs和免疫球蛋白浓度的影响Table 5 Effects of PAL supplementation on serum TP, GH, IGFs and immunoglobulin concentrations of calves

续表5项目 Items日龄 Days of age组别 Groups对照 Control凹凸棒土 PALP值 P-value免疫球蛋白AIgA/(μg/mL)2164.04±1.91b75.55±3.86a0.0445666.01±3.1382.28±6.490.0876367.55±2.22b82.58±3.83a0.028免疫球蛋白GIgG/(μg/mL)21895.35±30.251164.58±35.810.12156860.91±56.81b1219.63±50.83a0.03663956.23±52.201195.91±59.530.119免疫球蛋白MIgM/(μg/mL)2166.81±5.01b82.01±2.15a0.0495669.20±5.3280.21±9.830.3816378.44±6.0298.95±10.100.228

2.4 饲粮中添加PAL对犊牛血清炎症因子浓度和抗氧化指标的影响

由表6可知，与对照组相比，饲粮中添加PAL显著增加了21日龄犊牛血清IL-4的浓度(P<0.05)，显著降低了63日龄犊牛血清TNF-α和IL-6的浓度(P<0.05)。与对照组相比，饲粮中添加PAL显著增加了63日龄犊牛血清GSH-Px的活性和T-AOC(P<0.05)，显著降低了63日龄犊牛血清MDA的浓度(P<0.05)。

表6 饲粮中添加PAL对犊牛血清炎症因子浓度和抗氧化指标的影响Table 6 Effects of PAL supplementation on serum inflammation cytokine concentrations and antioxidant indexes of calves

2.5 饲粮中添加PAL对犊牛肠道菌群的影响

由表7可知，与对照组相比，饲粮中添加PAL显著增加了21日龄犊牛肠道总菌以及63日龄犊牛肠道双歧杆菌和芽孢杆菌的数量(P<0.05)，显著降低了21和63日龄犊牛肠道大肠杆菌的数量(P<0.05)，对犊牛肠道乳酸菌和栖瘤胃普雷沃氏菌的数量没有显著影响(P>0.05)。

表7 饲粮中添加PAL对犊牛肠道菌群的影响Table 7 Effects of PAL supplementation on intestinal microflora of calves lg(拷贝数/g)

3 讨 论

3.1 饲粮中添加PAL对犊牛生长性能和腹泻率的影响

犊牛腹泻是犊牛的多发疾病，也是世界各地养牛企业生产力和经济损失的主要原因。2007年美国乳制品国家动物健康监测系统的报告指出，半数未断奶犊牛的死亡归因于腹泻[13]。因此，对腹泻的有效防控是犊牛生产管理中的一项重要议题。研究发现，PAL不但能够改善饲粮的适口性，促进动物机体新陈代谢和提高饲料转化率，而且还具有吸除肠道毒素，提高肠道屏障完整性和维持肠道微生态平衡的作用[14]。对泌乳奶牛的研究表明，饲粮中添加PAL能显著提高泌乳奶牛的产奶量和牛乳中蛋白质的含量，且无毒副作用[15]。在断奶仔猪[16]和肉鸡[17]的研究中发现，饲粮中添加PAL可显著提高生长性能且与抗生素促生长剂的差异不显著。此外，Su等[18]的研究表明，饲粮中添加PAL能通过增加肉鸡空肠和回肠的绒毛高度以及黏蛋白2(MUC2)、闭锁连接蛋白-1(ZO-1)和紧密连接蛋白2(Claudin2)的mRNA和蛋白表达提高肠道屏障的功能，降低腹泻率，提高生长性能。Lv等[19]的研究也表明，饲粮中添加2 000 mg/kg的PAL能显著降低断奶仔猪的粪便评分和腹泻率，提高生长性能。目前，对PAL的研究主要集中于仔猪和肉鸡，缺乏对犊牛的相关研究。本研究通过在犊牛饲粮中添加2 000 mg/kg的PAL发现，添加PAL不但显著提高了1～21日龄犊牛的ADG和ADFI，而且显著降低了1～21日龄犊牛的粪便评分和腹泻率。综合前人和本研究的结果发现，饲粮中添加PAL有提高动物生长性能和降低腹泻率的作用。在本研究中犊牛ADG和ADFI的提高可能与降低了腹泻率有关，而腹泻率的降低可能与PAL提高了犊牛的肠道屏障功能和抑制大肠杆菌等有害菌的生长、维持正常的肠道微生态平衡有关。

3.2 饲粮中添加PAL对犊牛血清生化指标的影响

PAL的抗炎和免疫调节作用已被广泛报道。免疫球蛋白是反映机体免疫功能的重要指标，主要包括IgG、IgM、IgA，由淋巴细胞和浆细胞分泌产生，是机体抵御疾病、防范感染的重要屏障[20]。因此，血清中免疫球蛋白的浓度与犊牛的免疫力密切相关。此外，炎症因子在免疫调节和炎症反应中也发挥重要作用，IL-6和TNF-α由单核巨噬细胞和Th1细胞分泌，主要起促发炎症的作用，是应激性损伤的直接介导物，IL-4和IL-10由Th2细胞分泌，可减轻炎症反应，在激活局部及全身抗体应答中起关键作用[21]。研究表明，饲粮中添加PAL不仅可以提高肉鸡的ADG，还能够提高肉鸡血清IgA、IgG、IgM的浓度和降低肉鸡血清和肠道IL-6、TNF-α、白细胞介素-8(IL-8)和干扰素-γ(IFN-γ)的浓度，调节免疫和炎症反应[22]。Zhang等[6]对断奶仔猪的研究也发现了类似的结果。本研究发现，饲粮中添加PAL显著增加了21日龄犊牛血清IgA、IgM、IL-4和56日龄犊牛血清IgG的浓度，显著降低了63日龄犊牛血清IL-6和TNF-α的浓度，与以上研究结果一致。综上所述，饲粮中添加PAL能通过提高动物机体的免疫功能和降低炎症反应维持机体的健康状态。动物机体免疫功能的提高和炎症反应的降低有利于抵抗应激，这可能也是PAL组犊牛ADG增加和腹泻率降低的原因之一。

机体细胞内环境随着生物代谢的进行会产生超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢等活性氧簇，当累积超过一定限度，便会对细胞产生毒害作用，通常情况下，自由基的产生、利用和清除处于动态平衡状态，当过多的自由基无法被清除时，就会引起机体氧化损伤[23-24]。因此，抗氧化能力是维持机体健康的重要因素。血清GSH-Px、T-SOD活性和T-AOC均可反映机体的抗氧化能力，MDA是细胞膜脂质过氧化的产物，其浓度能反映体内自由基的含量和细胞的损伤程度。本研究发现，63日龄犊牛血清MDA的浓度高于21和56日龄犊牛，推测这可能与断奶对犊牛造成了应激有关，相较于对照组，PAL组63日龄犊牛血清GSH-Px的活性和T-AOC显著提高，而MDA的浓度则显著降低，这表明饲粮中添加PAL可改善犊牛由于断奶而产生的氧化应激反应。Zhou等[25]的研究也发现，饲粮中添加2%的PAL能显著提高肉鸡血清和空肠T-AOC，降低MDA的浓度。此外，对断奶仔猪的研究也表明，饲粮中添加PAL能显著降低血清和小肠中过氧化氢、MDA和机体内自由基等的浓度[15]。综上可知，饲粮中添加PAL能通过提高抗氧化酶活性和降低氧化终产物浓度提高动物机体抗氧化应激的能力。

3.3 饲粮中添加PAL对犊牛肠道菌群的影响

稳定的肠道菌群对犊牛的生长、健康和免疫功能至关重要。犊牛由于胃肠道尚未完全发育，为病原菌在肠道内定植提供了有利条件，导致腹泻等肠道相关疾病的发生，其中大肠杆菌是诱发犊牛腹泻的主要原因之一[26]。双歧杆菌、芽孢杆菌、乳酸菌等肠道有益菌能通过竞争营养物质和位点，产生多黏菌素和短杆菌肽等生物活性物质抑制病原菌的入侵和定植，保护肠道免受损伤[27-28]。Qiao等[7]的研究发现，饲粮中添加PAL可以通过增加蛋鸡盲肠内容物中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量有益调节肠道菌群结构。此外，Yao等[29]的研究表明，喂服PAL能有效防治鼠沙门氏菌感染引起的小鼠腹泻。这与本研究的结果类似，本研究发现，相较于对照组，PAL组1～21日龄和57～63日龄犊牛的粪便评分和腹泻率显著降低，PAL组21和63日龄犊牛肠道大肠杆菌的数量也显著降低，而63日龄犊牛肠道有益菌双歧杆菌和芽孢杆菌的数量则显著增加。因此，我们推测PAL降低犊牛腹泻的原因可能与肠道大肠杆菌数量的减少和双歧杆菌、芽孢杆菌数量的增加有关。以上结果表明PAL在维持肠道微生态平衡和机体健康方面具有有益的作用。

4 结 论

本试验条件下，饲粮中添加2 000 mg/kg PAL能提高荷斯坦犊牛的ADG(1～21日龄)，提高血清免疫球蛋白浓度和抗氧化应激能力，降低炎症反应，促进肠道有益菌和抑制大肠杆菌的生长，降低腹泻率。