江汉鸡群体FSHβ 基因遗传多态位点分析

黄 涛，潘爱銮，申 杰，吴 艳，蒲跃进，张 昊，孙 静，梁振华，杜金平，朱昌友，皮劲松

（1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省农业科技创新中心/动物胚胎与分子育种湖北省重点实验室，武汉 430064；2.湖北省畜牧良种场，武汉 434010）

江汉鸡为中国地方品种，是湖北省非常重要的地方鸡遗传资源。江汉鸡是在江汉平原上进化长时间驯化而成的，具有自身明显的特征，以黄麻羽居多，体重较轻，属蛋肉兼用型，自然群体里有部分鸡产绿壳蛋［1］。虽然江汉鸡具有产品品质好、抗逆性强、耐粗饲等优点，但也存在一些不足，主要表现在生长速度较慢、产蛋少、饲料转化率低、生产成本高［2］。湖北省农业科学院畜牧兽医研究所家禽试验场开展对江汉鸡的保种与开发利用工作，基于江汉鸡的配套利用［3］进行选育，挖掘江汉鸡遗传特色是对其进行开发利用的紧迫任务，获取江汉鸡群体遗传变异信息，对功能位点的预测与筛选或许有利于今后的开发利用。

卵泡雌激素（FSH）是促卵泡素（Follicle stimulating hormone，FSH），由垂体前叶分泌，是一种糖蛋白激素。FSH 分子是由α 和β 2 个亚基组成的异质二聚体，当β 亚基与α 亚基结合时其才具有生物学活性［4］。FSHβ基因对鸡性成熟和生殖等具有调控作用，能刺激卵泡发育和成熟，产生雌激素和促进排卵。李江曼［5］在不同品种鸡的FSHβ基因检测到单碱基突变位点与宁都黄鸡的产蛋性能显著相关；秦玉梅等［6］在鸡FSHβ基因中发现该位点与玫瑰冠鸡和海兰褐蛋鸡300 日龄产蛋数显著相关。本研究基于基因组重测序结果鉴定江汉鸡群体FSHβ基因的遗传变异信息，通过生物信息学方法预测功能性变异位点。

1 材料与方法

1.1 试验样品

江汉鸡来源于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所家禽试验鸡场。在18 周龄时随机抽取30 只进行腋下采血，于抗凝管中保存。DNA的提取采用天根DNA 提取试剂盒（TIANamp Blood DNA Kit）进行，提取的DNA 用NanoDrop 2 000 进行浓度测定。将各样品稀释到100 ng/μL，然后每个样品取3 μL进行混池。

1.2 重测序分析

DNA 样品送往百易汇能公司进行建库测序。在获取原始数据后，首先使用cutadapt 软件进行clean reads 操作。下载Galgal6 参考基因组，使用bwa 软件建立索引。运用SAMtools 软件对clean reads 进行序列比对组装。生成Bam 文件，建立索引后导入IGV软件中收集变异位点。使用GATK 软件对bam 文件进行变异位点整理生成vcf文件，该文件里包含基因组遗传变异信息。

1.3 生物信息学预测

针对FSHβ基因序列中的遗传变异，筛选潜在的功能性变异。分析内容包括3 个部分，分别为M6A 分析、调控元件分析和miRNA 结合位点预测分析。设定mRNA（NM_204257.1）序列第一个碱基为+1。使用RNAfold web server 进行cds 区二级结构分析；使用SRAMP（http：//www.cuilab.cn/sramp/）在线软件对序列进行M6A 分析；在对调控元件进行分析时，采用JASPAR（http：//jaspar.genereg.net/）在线分析软件，设置置信参数大于85。在对miRNA 结合位点预测分析时，采用miRDB（http：//mirdb.org/）在线软件进行分析，保留target score为60以上的结果。

2 结果与分析

2.1 江汉鸡群体FSHβ 基因遗传变异

基于基因组重测序数据，获取江汉鸡群体FSHβ基因所有遗传变异信息（图1、图2）。FSHβ基因包括有2 个内含子和3 个外显子。外显子又可以分为5′utr、cds和3′utr。本研究在江汉鸡群体中发现该基因共有35 个SNPs 和2 个indels。其中外显子有31个SNPs，其分布为5′utr 区0 个，cds 区2 个，3′utr 区29 个；内含子有4 个SNPs。此外，发现的2 个indels位于3′utr区。

图1 江汉鸡群体FSHβ 基因内遗传变异信息统计

图2 江汉鸡FSHβ 基因内出现6 个连续碱基indel（红框）

2.2 FSHβ 蛋白结构分析

在江汉鸡中发现位于FSHβ基因cds 区有2 个SNPs，位于+297 位置G 突变成A，属于非同义突变，造成其由甘氨酸变成丝氨酸。位于+431 位置C 突变成T，属于同义突变，未发生氨基酸变化。比较非同义突变对RNA 二级结构的影响，结果发现，G 突变成A 自由能由-441.29 kJ/mol 变为-444.22 kJ/mol，C突变成T自由能由-441.29 kJ/mol变为-441.71 kJ/mol。+297 和+431 位点 突变 前后cds 区RNA 二级结构变化情况见图3。甘氨酸突变成丝氨酸，蛋白质分子式由C643H967N161O203S17变成C644H969N161O204S17。总平均亲水性由-0.069 变成-0.072，不稳定指数和理论等电点未发生变化。

图3 突变对FSHβ 二级结构的影响

2.3 FSHβ 基因M6A 分析

使用SRAMP 在线软件对FSHβ的mRNA（NM_204257.1）序列进行分析，预测M6A 修饰位点。结果显示该转录本内有10 个潜在的M6A 修饰位点，对应的位置分别在+110、+152、+376、+392、+518、+1398、+1408、+1684、+1691、+1874。其中，1 个位点具有极高置信度（very high confidence），5 个位点具有高置信度（high confidence），3 个位点具有中置信度（moderate confidence），1 个位点具有低置信度（low confidence），这10 个位点在江汉鸡群体中没有发生遗传变异。

2.4 FSHβ 基因调控元件预测分析

使用JASPAR 在线软件对FSHβ的mRNA（NM_204257.1）序列进行分析，预测转录因子结合位点。在设置置信参数为85%后，获取70 个潜在的转录因子调控元件，主要涉及5 个转录因子（图4），分别包括TFAP2A、RUNX1、AG、AGL3 和arnt。在江汉鸡群体中，发现7 个SNPs 位于调控元件的序列中（表1）。值得注意的是，TFAP2A 靶向的调控元件序列中分别包含2 个SNPs，且都位于正链上。

表1 FSHβ 基因转录本内有江汉鸡遗传变异位点的调控作用元件

图4 转录因子种类与数量统计结果

2.5 FSHβ 基因靶向miRNA 预测分析

使用miRDB 在线软件对FSHβ的mRNA（NM_204257.1）序列进行分析，预测miRNA 结合位点。设置分数在60 以上后获取51 个miRNAs，这些miRNAs具有靶向转录本调控基因表达的潜力。通过对这51个miRNAs的种子序列进行分析，发现部分miRNA的种子序列中包含有江汉鸡SNPs。其中gga-miR-6605-5p的种子序列中包含多达3 个SNPs。将种子序列有SNPs的miRNAs 列出（表2），可用于江汉鸡繁殖性状中的调控作用研究。

表2 种子序列中包含有江汉鸡遗传变异位点的miRNAs

3 小结与讨论

随着基因组重测序技术的普及，获取地方鸡基因组遗传变异信息变得越来越容易。但是，如何在海量的遗传变异位点中筛选出功能性变异依然具有很大的挑战性。地方遗传资源的开发与利用，归根结底要利用功能性的遗传变异进行遗传改良，而这也是应用性研究的主要内容。本研究关注繁殖激素FSH的β 亚基基因序列，利用基因组重测序技术，获取该基因序列在江汉鸡群体中所有的遗传变异位点。通过M6A 预测分析、调控元件预测分析和miRNA 结合序列分析，筛选出具有潜在功能性的遗传变异位点，用于今后的进一步研究。

FSHβ基因内有丰富的遗传变异位点，且存在品种特性。王鹏等［7］在儋州鸡FSHβ基因鉴定出25 个SNP 位点，其中21 个SNPs 也存在于江汉鸡群体中。通过比较发现，两个品种之间有部分SNPs 属于品种特有，这些遗传变异位点具有较高的研究价值。

FSHβ基因富含遗传多态位点，有报道与产蛋性状有关。在江汉鸡+931 位置SNP，洪坤月等［8］发现该位点与绿壳蛋鸡开产日龄相关。在江汉鸡+1024位置有SNP，田艳苓等［9］发现该位点与济宁百日鸡开产日龄有关。李江曼［5］在+868 位置发现SNP 与宁都黄鸡产蛋性能显著相关，但是江汉鸡群体中没有该变异。在江汉鸡转录本3′utr 区+1299 位置为纯合型，但在玫瑰冠鸡和海兰褐蛋鸡中，秦玉梅等［6］发现该位置的碱基突变，且与300 日龄产蛋数有关，该结果与孙杰等［10］的研究结果基本一致。王亚男［11］在FSHβ基因中发现了3 处SNPs 与京海黄鸡体增重有关，3 处变异位点对应在转录本+606、+607 和+898位置，该位置与江汉鸡变异情况一致，预测结果显示+606、+607 位置位于TFAP2A 调控元件内，推测在体增重过程中其参与一定调控作用。韩厚明［12］在文昌鸡FSHβ基因外显子中发现3 处SNPs，其对应在转录本+898、+931 和+1024 位置，与江汉鸡变异情况一致。不过，文昌鸡中上述3 个位点未见与产蛋性能关联。

总之，对江汉鸡FSHβ基因进行遗传多态性分析，发现35 个SNPs 和2 个indels。值得注意的是，在这些变异位点之中，1 个SNP 位于cds 区造成甘氨酸变成丝氨酸。此外还发现7 个SNPs 位于潜在的调控元件序列中，7 个SNPs 和1 个indel 位于潜在的miRNA 结合序列中。所筛选的上述遗传变异位点，可能参与了FSHβ基因的表达调控，在江汉鸡遗传特性中扮演一定的角色。