m6A修饰在结直肠肿瘤发生发展中的研究进展及潜在治疗价值

刘婧依, 李 冰, 徐恩盼, 钟芸诗

0 引言

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是我国较常见的恶性肿瘤. 据报道[1], 结直肠癌的发病率居全球第四, 死亡率居全球第二. 我国2018年癌症统计报告显示, 结直肠癌的发病率和死亡率分别居我国恶性肿瘤的第三位与第五位, 其发病率近年来持续升高且多数患者在确诊时已属于中晚期[2]. 结直肠肿瘤由腺瘤演变为结直肠癌是一个近十年的多步骤肿瘤发生病理过程, 原癌基因和抑癌基因的异常突变及积累在此过程中具有重要作用[3,4]. 其中包括DNA基本核苷酸发生变化的基因组可遗传改变及核苷酸序列未改变、引起基因表达和功能改变的稳定遗传, 即表观遗传.

表观遗传修饰具有动态可逆性和可遗传的特点, 包括: DNA的甲基化修饰、组蛋白修饰、染色质重塑、微小RNA(microRNA , miRNA)和非编码RNA(non coding RNA, ncRNA)修饰等, 在结直肠肿瘤的发生发展中扮演重要角色. 近年来, 关于DNA组学和蛋白质组学在肿瘤发生发展中的研究逐步取得重大突破, RNA水平的表观遗传修饰也吸引了众多研究者的目光[5,6].

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)是指在RNA腺苷酸(A)上的第六位氮(N)上发生甲基化, 为真核生物mRNA水平上最丰富的表观遗传转录组学修饰, 占所有腺苷的0.1%-0.4%左右[7]. m6A修饰已被证实在多种肿瘤性疾病中出现异常表达, 且参与到肿瘤细胞增殖、转移、侵袭和血管生成等一系列恶性生物学行为中[7]. 早在1974年, Desrosiers等[8]在Novikoff肝癌细胞中首次发现了真核生物mRNA中poly(A)存在的m6A甲基化修饰. 但由于分子生物学、定量及测序技术的不成熟, m6A的相关研究在此后数十年中一直未取得突破性进展. 随着实验技术及m6A-seq和MeRIP-seq等m6A修饰相关的高通量测序技术飞速发展, m6A修饰作为全新的真核生物表观遗传转录组修饰出现, 成为各个疾病RNA修饰领域中的研究热点[9]. 已有大量研究表明[10], m6A修饰在结直肠肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用. 本文将对m6A的生物学特征, m6A RNA的修饰调控机制以及m6A RNA甲基化修饰在结直肠肿瘤发生发展中的作用进行综述, 旨在为近一步寻找生物标记物和治疗靶点提供依据.

1 m6A的生物学特征

与DNA甲基化的调控机制相似, m6A修饰具有动态可逆的特点, 能够调控tRNA、rRNA和多种ncRNAs,例如miRNAs、长链非编码RNA(long coding RNA, lncRNAs)及环状RNAs(circular RNA, circRNAs)的功能, 影响其成熟、转录、定位、翻译、稳定性以及一些非编码RNA的表观遗传效应[11]. 通过新的基因检测技术配合高通量测序技术, 研究者发现m6A修饰在RNA上并非随机分布, 而是富集于在3′-非编码区(3′untranslated region, 3′ UTR)、终止密码子和内部长外显子周围的RRm6ACH序列中([A/G/U][A/G]m6AC[A/C/U])[12], 并于5′-非编码区(5′- untranslated region, 5′ UTR)和长外显子周围进行翻译[13,14].

越来越多的证据表明, m6A几乎参与到RNA代谢活动的各个方面, 包括pre-mRNA剪接、末端加工、RNA出核、翻译调控活动、mRNA衰变和ncRNA加工等[15]. 在此基础上, m6A修饰参与哺乳动物体内多种生物学行为, 包括神经系统发育、昼夜节律、DNA损伤反应、热休克反应和肿瘤发生发展, 并且在其中发挥多种生物学作用[16].

2 m6A RNA的修饰调控机制

m6A修饰的动态性和可逆性由两种重要的催化蛋白调控所维持, 包括甲基转移蛋白(Writers)和去甲基化蛋白(Erasers)[17]. 除此之外, 解码蛋白(Readers)能够识别RNA上的m6A修饰位点并且读取相关生物学信息, 进一步招募下游的功能复合物发挥生物学功能[10].

m6A甲基转移酶能够以S-腺苷甲硫氨酸为供体, 催化RNA上的m6A甲基化修饰形成. m6A甲基转移酶由多种Writer蛋白组成, 包括甲基转移酶样物3(methyltransferase like 3, METTL3)、METTL5和METTL14及共同作用因子Wilms肿瘤1相关蛋白(wilms tumor 1-associating protein, WTAP)、RNA结合基序蛋白15(RNA-binding motif protein, RBM15/15B)、Cbl原癌基因样蛋白-1(Cbl proto-oncogene-like 1, CBLL1)也称为HAKAI、CCCH型锌指蛋白13(zinc finger CCCHtype containing 13, ZC3H13)和Vir同源m6A甲基转移酶样物(vir like m6A methyltransferase associated, VIRMA). METTL16可独立作用, 与snRNA和其他ncRNA相结合, 例如多种lncRNA和pre-mRNA, 催化mRNA上3′UTR和snRNA上U6-m6A 43的甲基化, 并且在pre-mRNA的剪切过程中发挥重要的作用[18,19]. 除METTL16外的其他Writer蛋白组成了m6A转移酶复合物, 其中METTL3是核心成分起主要催化作用, METTL14则作为其结构支撑, 形成形成异源二聚体[17,20,21]. 而其他的Writer蛋白, 例如WTAP、RBM15/15B、CBLL1、ZC3H13和KIAA1429等则通过参与组成甲基转移酶及提高其稳定性来调控m6A修饰水平[22-25].

m6A去甲基化酶, 又称为Eraser蛋白, 能够识别并移除RNA上的m6A甲基化修饰. 不同于甲基化酶复合体由多个Writer蛋白组成, 已发现的能够独立作用的去甲基化酶类较少. 脂肪肥胖相关蛋白(fat mass and obesityassociated protein, FTO)和AlkB同系物5(AlkB Homolog 5, ALKBH5)为较常见的Eraser蛋白, 降低细胞核内RNA的m6A甲基化修饰水平. 新发现的ALKBH3则更倾向于调控tRNA的m6A甲基化的丰度[26]. 在2011年, FTO首次被证明可以降低细胞核内的m6A修饰水平, 揭示了m6A修饰的可逆性, 在m6A的相关研究中取得重大突破[27]. Linder等[28]发现FTO与ALKBH5不同, 可在细胞质中介导N6, 2-O-二甲基腺苷(N6, 20-O-dimethyladenosine, m6Am)的去甲基化反应, 揭示了FTO作用的空间性.

Reader蛋白可识别RNA上的m6A修饰位点, 以完成下游不同的生物学功能. YTH结构域家族蛋白是最早发现的Reader蛋白, 其中包括YTH m6A RNA结合蛋白

(YTH N6-Methyladenosine RNA binding protein, YTHDF)

亚型(YTHDF1/2/3)和YTH结构域包含蛋白(YTH domain containing, YTHDC)亚型(YTHDC1/2)[14,29,30]. 此后, 研究者们陆续发现了其他的Reader蛋白, 例如: 异核核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C, hnRNPC)和胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(insulin like growth factor 2 mRNA binding protein, IGF2BPs)[31-33]. 各种Reader蛋白的定位与作用方式各不相同. 例如, YTHDF亚型蛋白主要位于细胞质中, 促进RNA翻译的起始或者加速RNA降解[15,33]. YTHDC1通过招募pre-mRNA的剪接因子, 促进其与靶基因位点结合, 从而调控mRNA的剪接[34]. 与YTHDF2促进mRNA降解的功能不同, IGF2BPs通过识别m6A修饰位点来增强mRNA稳定性和促进翻译[31].

Reader蛋白在多水平上通过特异性识别m6A修饰位点来调节mRNA的表达和蛋白质合成, 发挥生物学作用. 新的Reader蛋白也陆续被发现, 但Reader蛋白选择性结合具有m6A修饰mRNA的机制还不明确, 为探索m6A修饰和其生物学功能提供了更广阔的研究空间.

3 m6A在结直肠癌中的作用机制

近年来, m6A修饰逐渐成为结直肠肿瘤发生、发展及转移领域中的研究焦点. m6A修饰广泛地改变了某些结直肠肿瘤相关基因的表达. 结直肠肿瘤中异常表达的Writer蛋白, Erase蛋白和Reader蛋白, 通过调节不同RNA上的m6A水平, 影响下游通路的功能, 例如与结直肠肿瘤发生和凋亡的经典通路, Wnt通路和Hippo通路, 起到促癌或抑癌的作用(表1)[35-38].

表1 m6A调节分子在结直肠肿瘤中的作用

3.1m6A“编码器”在结直肠肿瘤中的作用机制 m6A甲基转移酶包含多种Writer蛋白, 参与调节多方面的RNA代谢活动, 包括pre-mRNA剪接、末端加工、RNA出核、翻译调控活动、mRNA衰变和ncRNA加工等[60]. 与其他调节因子的单一特性不同, METTL3在结直肠癌的发病进展中同时具有促癌和抑癌的双重作用. 有研究表明, METTL3的高表达与结直肠癌患者较差的预后相关. MeRIP-m6A-seq分析提示SOX2是METTL3的下游甲基化RNA. 经过m6A修饰后的SOX2 mRNA由Reader蛋白IGF2BP2所识别后, 半衰期延长, 促进结直肠癌的发展, 即METTL3通过依赖m6A-IGF2BP2的机制促进结直肠肿瘤的进展[39]. 另一研究表明[40]结直肠癌中METTL3可通过调节miR-1246/SPRED2/MAPK经典通路加快结直肠癌的侵袭和转移. 同时, 其他研究发现结直肠癌中METTL3的下调会激活p-p38和p-ERK, 并且在METTL3基因敲除的细胞中迁移和侵袭能力增强, 在p38或ERK激酶抑制剂进行干预后增强的迁移和侵袭能力得到逆转. 也就是说METTL3可以通过经典的p38/ERK通路抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭, 提示了METTL3在结直肠癌中的双重作用[48].

近日, Chen等[42]通过构建CRISPR/Cas9文库、结直肠癌患者类器官模型及转基因小鼠模型指出METTL3通过激活m6A-GLUT1-mTORC1轴促进结直肠癌进展, 或可作为结直肠癌的治疗靶点.

作为METTL3的结构支撑, METTL14与其形成异源二聚体, 调节m6A修饰水平. 不同于METTL3的双重作用, METTL14在结直肠肿瘤中呈现抑癌的表型. METTL14能够减少促癌因子lncRNA XIST表达和加快SOX4 mRNA的降解, 抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和癌灶的转移[35,49]. 以上METTL14所介导的lncRNA与mRNA 的m6A甲基化修饰, 均具有YTHDF2依赖性. 同时METTL14分别通过miR-375/YAP1通路和miR-375/SP1通路抑制癌细胞生长和结直肠癌细胞迁移和侵袭[38]. 但在急性髓系白血病和乳腺癌中, METTL14作为促癌因子, 加快疾病进展. 可见现仍不可认为METTL14在结直肠癌中仅具有单一抑癌特性.

2014年, 有研究发现[25]WTAP在哺乳动物中可作为m6A甲基转移酶的调节亚基, 参与m6A的修饰. 作为较新的m6A相关Writer蛋白, WTAP在多种恶性肿瘤相关疾病中体现出促癌的作用, 例如肝癌, 胃癌及骨肉瘤等[61-63]. 在结直肠癌中, 有研究指出[50]WTAP同样作为促癌基因, 通过经典的Wnt信号通路中的WTAP/WT1/TBL1轴促进结直肠癌的发病进展. 因此对于WTAP在结直肠癌发病中的作用机制仍需进一步的研究探索.

无论是METTL3在结直肠肿瘤中的双重作用, 还是METTL14其他肿瘤中表现的促癌作用, 均提示我们, Writer蛋白不同的下游靶基因上的m6A修饰位点有区别, 影响其参与的各种信号通路的激活状态, 从而在肿瘤中发挥特异的作用.因此如何针对这一特点, 保留调节因子的抑癌作用, 利用抑制剂或开发新的药物, 阻止在特定信号通路中其促癌信号的传递, 可以成为下一步探究m6A修饰在结直肠肿瘤疾病进展中的方向.

3.2 m6A“橡皮擦”在结直肠肿瘤中的作用机制与m6A甲基转移酶不同, 在结直肠癌领域中, Eraser蛋白和Reader蛋白的相关机制研究则较少. 有研究发现[52,53]FTO在细胞核内收到miR-1266的调控, 启动细胞信号分子STAT3, cyclin D1和MMPs等促进结直肠癌的发展. 另外, Yue等[64]近期发现FTO受到miR-96的调控, 影响经典的促癌基因MYC的甲基化水平, 提高MYC的表达量, 从而参与了miR-96在结直肠癌中的促增殖和抗凋亡的作用.而在细胞质中, FTO则能够动态地调节m6Am修饰起到对结直肠癌细胞干性的调控作用且影响肿瘤耐药性[54].

伴有肝转移的结直肠癌患者预后较差, 因此一直是结直肠癌研究领域中的重点.近日来, 另一个去甲基化酶ALKBH5介导结直肠癌转移和免疫治疗耐药性的机制研究也取得了初步进展. ALKBH5在结肠癌中表达下调, 且与肿瘤转移相关, 并且指出该分子可作为患者预后的独立预测指标. 该研究进一步应用体内体外实验证实了ALKBH5的抑癌作用[55]. 结直肠癌的肿瘤微环境同样十分复杂, 与癌症较快进展、发病人群年轻及较早肝转移紧密相关. Li等[56]发现ALKBH5的m6A去甲基化作用能够影响结直肠癌的肿瘤微环境, 从而介导结直肠癌患者对抗PD-1治疗耐药, ALKBH5抑制剂则能够显著地改善免疫治疗疗效, 为结直肠癌、黑色素瘤及其他恶性肿瘤的靶向治疗提供了新的可能性. 除此之外, 林奇综合症相关的结直肠癌中, ALKBH5表现出其DNA水平的高甲基化, 提示其可能作为全新的甲基化DNA标记物来判定结直肠癌与林奇综合症的相关性[65]. 因此ALKBH5未来不仅可以作为结直肠癌临床治疗的突破靶点, 更是具有成为患病人群全新生物标记物的潜力.

研究中提到FTO具有空间性, 在细胞质中介导m6Am的去甲基化反应. 特别是m6Am修饰在结直肠肿瘤中的作用并无过多研究, 为下一步的研究提示了方向. 除此之外, 对于Alkb亚家族其他成员的在结直肠肿瘤中的功能机制研究仍是空白, 寻找家族中新的m6A修饰相关分子及研究其机制仍是可以突破的方向.

3.3 m6A“解码器”在结直肠肿瘤中的作用机制在结直肠癌患者中, YTHDF1的转录和翻译水平显著地增高. 有研究分析了TCGA数据库中418例结肠腺癌患者及41例对照组的数据, 发现在结肠腺癌中YTHDF1的表达增加, 而YTHDF3等分子相反, 提示这些YTH家族的分子可能与结肠腺癌检出、进展和预后相关, 有成为全新结肠腺癌相关生物标记物的可能[36].

Reader蛋白读取在结直肠肿瘤信号通路关键分子的m6A修饰位点, 影响这些基因的表达水平和RNA稳定性等. 除此之外, Reader蛋白还与结直肠肿瘤相关的非编码RNA形成复合物, 提高其稳定性. 在体外及体内实验中, 通过干预手段使YTHDF1的表达水平降低能够明显地抑制结直肠癌细胞和小鼠异种移植模型肿瘤发生. 另外, YTHDF1通过抑制经典的Wnt/β-catenin通路, 提高肿瘤细胞干性以促进肿瘤发生[37]. 由此可见, YTHDF1在结直肠癌的发病过程中起到重要的作用. 另一个YTHDF亚型的分子YTHDF3通过调节Hippo通路中的lncRNA GAS5-YAP-YTHDF3负反馈轴而影响结直肠癌的进展[57]. 属于YTHDC亚型的分子YTHDC2是一种依赖ATP的RNA解旋酶,YTHDC2基因的下调能够显著地抑制肿瘤转移相关基因的翻译, 例如缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1alpha, HIF-1α), 而该分子的高表达与结肠癌的肿瘤分期和转移成正相关[59]. IGF2BP2在细胞质中与含有m6A甲基化修饰的circNSUN2相结合, 通过形成circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2 RNA-蛋白质复合物提高HMGA2的稳定性, 同样介导结直肠癌的肝转移[58].

4 m6A在结直肠肿瘤中的潜在治疗价值

m6A甲基化修饰在特定RNA转录本上的甲基化及去甲基化之前的平衡影响多种疾病的发生进展. 因此对m6A在结直肠癌中所扮演的角色进行深入的研究可为肿瘤的临床干预提供更多的潜在治疗靶点, 同时m6A相关蛋白的调节因子和抑制剂也为结直肠癌的代谢、免疫等治疗和改善耐药性提供全新可能. 例如开发促癌因子YTHDF1及METTL3的抑制剂, 或者抑癌因子METTL14的激动剂, 均可能成为治疗结直肠癌的全新策略. 多种m6A抑制剂已被开发用于m6A相关机制的研究及传统或再生医学中, 并且仍有大量的相关干预试剂亟待开发.去甲基化酶FTO的抑制剂种类较多, 包括大黄酸、右旋-二羟基戊二酸(R-2-hydroxyglutarate, R-2HG)、HIF脯氨酰羟化酶-2抑制剂[(1-chloro-4-hydroxyisoquinoline3-carbonyl)glycine, IOX3]、FB23、MO-I-500和甲氯芬那酸(Meclofenamic acid, MA)等. 作为一种抗癌药物, FTO抑制剂目前虽在结直肠癌中应用较少, 但在多种恶性肿瘤中被证实具有抗肿瘤作用, 包括三阴性乳腺癌, 急性髓系白血病和神经胶质瘤等[66-69]. 另外有研究发现, MA是FTO高选择性的m6A去甲基化酶抑制剂, 不抑制ALKBH5的去甲基化作用[70]. 在2019年, 研究人员开发了一种更加有效的FTO抑制剂FB23-2, 能够在急性髓细胞性白血病动物模型中缓解其恶性进展[71]. 因此, FTO能否作为结直肠癌的治疗靶点, FTO抑制剂能否在结直肠癌及其他实体肿瘤中得到应用, 改善患者的预后, 值得研究者对其进一步的深入研究和证实.

癌细胞对包括化疗、放疗和靶向治疗等癌症治疗策略产生耐药性是恶性肿瘤治疗失败或者复发的重要原因. m6A相关因子在各类癌症发挥重要作用, 这些调节因子的失调与肿瘤的耐药性有关. FTO通过减少β-catenin 在mRNA水平的m6A修饰, 介导了宫颈鳞状细胞癌对放化疗的抵抗作用[72]. 基于上述研究, β-catenin作为结直肠腺瘤-癌时间序列过程Wnt通路的重要效应分子, 是否以上述FTO介导的机制导致结直肠肿瘤耐药, 也可以在接下来的研究中尝试验证. 另一去甲基化酶ALKBH5可作为一个潜在的结直肠癌治疗靶点, 提高免疫治疗的疗效. ALKBH5通过调节Mct4/Slc16a3的表达、肿瘤微环境中乳酸的含量及肿瘤浸润Treg细胞和髓系抑制细胞的组成, 介导了多种恶性肿瘤对于抗PD-1免疫疗法的耐药性[56]. 另外, 研究者构建了RNA修饰的Writer蛋白评分(WM Score), 证实了WM评分在结直肠癌中与MAPK、EGFR、和mTOR等经典致癌通路的靶向药物敏感性成负相关, 而与干扰细胞凋亡和细胞周期药物耐药性成正相关, 同时与靶向PD-1的药物也有关联, 提示了针对Writer蛋白开发相关药物可能提高免疫治疗的临床效益[73].

处于关注焦点的甲基转移酶核心蛋白METTL3通过提高Sec62 mRNA上的m6A修饰水平, 使其更倾向于和Wnt通路中的β-catenin相结合, 介导了结直肠癌对于化疗的抵抗作用, 提示m6A/Sec62/β-catenin轴可作为改善结直肠癌化疗临床效益的潜在治疗靶点[43]. 同时, 有研究指出结直肠癌中M2极化的肿瘤相关巨噬细胞促进癌细胞中METTL3表达, 进而使m6A甲基化水平提高, 使结直肠癌对奥沙利铂产生耐药性[44].

虽然现阶段m6A的靶向治疗相关研究大多聚集在白血病、黑色素瘤及恶性胶质瘤等肿瘤相关疾病中, 但这也为研究人员对结直肠癌的靶向治疗及耐药性研究提供了丰富的思路和研究方向. 在结直肠癌的领域中, 针对m6A相关分子靶向药物的研究也具有相当大的价值, 但除了FTO外, 其他分子的抑制剂或者激活剂却鲜少有人研究. 最新的研究中, METTL3作为在结直肠肿瘤中已被证明具有双重作用的分子, 其在体内具有活性的小分子抑制剂STM2457首次被鉴定, 并证明了能够有效抑制AML的发展[74]. 由于对于其他的分子具体结构研究并不明确. 因此, 对于在结直肠肿瘤疾病进程中已经证明具有作用的m6A相关分子, 深入地研究它们的结构, 开发其干扰药物, 并且考虑其临床转化十分必要.

5 结论

综上所述, 随着近几年来大量研究人员的努力投入到m6A在癌症领域的相关研究中, 丰富了相关的实验数据和我们对于m6A在多种癌症发生发展中机制的认知. 在结直肠癌领域中, 对于m6A甲基化修饰的甲基转移酶复合体, 包括起到主要催化作用的METTL3研究较为全面, 其参与调控了多个肿瘤发生发展和细胞凋亡的经典信号通路. 但其他的Writer分子的研究仍较少, WTAP和可独立作用的METTL16在结直肠肿瘤中的作用仍不清晰. 同样地, Eraser和Reader蛋白虽已经被证明可以通过调控经典的信号通路, 例如Wnt通路和PI3K/AKT通路, 以及改变非编码RNA的m6A修饰水平, 参与结直肠肿瘤的发生发展、转移及耐药, 但由基础向临床的转化仍有广阔的进步空间. 尽管m6A 甲基化修饰在mRNA水平上较为丰富, 从以上研究来看, 肿瘤相关非编码RNA(miRNAs、lncRNAs和circRNAs)也同样受到m6A甲基化的调控, 在结直肠癌的疾病进展中发挥促癌或者抑癌的作用. circRNAs最新被发现可以编码多肽发挥作用, m6A修饰在其中是否扮演着关键角色以及具体机制吸引了研究者们的关注. 因此, 对于肿瘤相关非编码RNA的关注也必不可少.

另外, 现发现的Eraser蛋白较少, 仅有FTO和ALKBH5两个研究较丰富的分子. ALKBH3被证实具有去甲基化酶作用, 但Alk同系物家族仍还有很多我们未研究的领域, 日后探究更多该家族成员是否可以具有去甲基化酶作用仍是一个研究方向. Reader蛋白种类繁多, Reader蛋白特异性读取不同RNA上的m6A修饰并发挥下游不同功能仍是未知.

m6A作为一种具有可逆转特性的重要表观遗传修饰, 为之后的肿瘤诊治提供了无限可能. 大量关于m6A的研究提供了对结直肠肿瘤发生、转移、免疫应答和耐药性分子机制的全新认知, 同时推进了新疗法的开发, 但实现从理论到临床转化的过程仍需探索, 特别是应用于消除结直肠恶性肿瘤对现有疗法的耐药性.