锁阳醇提物和水提物对小鼠免疫功能的影响

2022-01-07 09:46:02热西代姆阿卜力孜杨建华胡君萍

新疆医科大学学报 2021年12期

李敏，热西代姆·阿卜力孜，杨建华，胡君萍

(新疆医科大学1药学院，乌鲁木齐 830011；2第一附属医院药学部，乌鲁木齐 830054)

锁阳（Cynomorium songaricumRupr.）为被子植物门双子叶植物纲蔷薇亚纲锁阳科植物锁阳的干燥肉质茎，别名地毛球、锈铁棒、锁严子等，主要分布于我国甘肃、新疆、青海等地[1-2]。锁阳性甘、温，具有益肾壮阳、通精血、利肝脏、通便、缓解衰老等作用，主要含有多糖、苷类、黄酮类、甾体类、有机酸类、三萜类、鞣质类、氨基酸类和矿物质元素等[3]，具有抗应激作用、调节机体免疫力、抗氧化作用、抑制血小板聚集、类糖皮质激素样作用、防癌、抗病毒和填髓生血等作用[4-5]。研究表明，锁阳免疫调节作用研究受到越来越多的关注，锁阳提取物、制剂、化合物群等对小鼠免疫系统具有一定的保护作用[6-10]，说明锁阳中的化学成分单独或联合发挥了增强机体免疫功能的作用。本研究采用正常生理和环磷酰胺所致免疫抑制小鼠为模型，以胸腺指数、脾脏指数、廓清指数、吞噬指数、血清溶血素水平、血清细胞因子含量为指标，探究锁阳水提物和醇提物对不同免疫状态小鼠免疫功能的调节作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器UVmini-1240型紫外-可见分光光度计（岛津国际贸易上海有限公司）；AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；KDC-160HR型台式高速冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司)；Multiskan GO型全波长酶标仪（美国Ther⁃mo scientific公司)。

1.2 试剂环磷酰胺（CTX，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号04131209）；盐酸左旋咪唑片（桂林南药股份有限公司，批号161105）；印度墨汁（北京博奥拓达科技有限公司，批号20180718）；小鼠白介素2（Inter⁃leukin，IL-2）、干扰素γ（Interferon，IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20180315、20180828、20180519）。绵羊红细胞（SRBC）的制备：绵羊颈静脉取血，置于有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃的冰箱中保存备用，2周内使用。豚鼠血清的制备：豚鼠心脏取血，全血于4℃放置15 min，3 000 r/min离心10 min，制得血清，-80℃保存备用。

1.3 药材锁阳药材2018年2月购于新疆百草堂医药连锁经销有限公司，经新疆医科大学药学院生药教研室丛媛媛教授鉴定为锁阳科锁阳属植物锁阳（Cynomorium songaricumRupr.）的干燥肉质茎。

1.4 动物昆明小鼠450只，SPF级，雌雄各半，体质量为（20±2）g，由新疆医科大学动物实验中心提供，动物生产许可证号：SYXK(新)2016-0002，动物合格证号：65000700000700。室温18℃~22℃，相对湿度40 %～60 %，昼夜光照节律12 h︰12 h，自由进食饮水，适应性饲养7 d后进行实验。

1.5 方法

1.5.1 锁阳醇提物和水提物的制备取锁阳药材1 kg，加10倍量75 %乙醇溶液，70℃加热回流提取3次，每次1 h，过滤，合并滤液，浓缩，干燥，得锁阳醇提物（得率17.02 %）。残渣用10倍量沸水回流提取3次，每次1 h，过滤，合并滤液，浓缩，干燥，得锁阳水提物（得率31.91%）。使用时研细以生理盐水配制成相应浓度。

1.5.2 动物分组与造模450只小鼠随机分为15组，每组30只，即空白组（生理盐水），模型组（CTX+生理盐水），阳性组（CTX+左旋咪唑30 mg/kg体质量），正常生理醇提物高、中、低剂量组（26、13、6.5 mg/kg体质量），正常生理水提物高、中、低剂量组（48、24、12 mg/kg体质量），CTX+醇提物高、中、低剂量组（40、20、10 mg/kg体质量），CTX+水提物高、中、低剂量组（72、36、18 mg/kg体质量）。第1~3天，模型组、阳性组和免疫抑制各组按80 mg/kg体质量的剂量ip给予CTX建立免疫抑制模型，之后每周强化1次。各组小鼠均在每天上午10︰00~11︰00按照剂量ig给予相应溶液，每天1次，连续30 d。

1.6指标的测定

1.6.1 免疫器官指数测定各组小鼠（n=10）于末次给药24 h后，称量体质量，摘眼球取血，颈椎脱臼处死之后摘取脾脏和胸腺，称重，记录。按以下公式计算：胸腺指数=胸腺重量（mg）/体质量（g）；脾脏指数=脾脏重量（mg）/体质量（g）。

1.6.2 廓清指数和吞噬指数测定采用碳粒廓清法测定小鼠巨噬细胞吞噬功能[11]。各组小鼠（n=10）于末次给药24h后，称量体重，每鼠尾静脉注射用生理盐水稀释5倍的印度墨汁，注入墨汁后开始计时，分别于2 min和10 min时从内眦静脉丛取血20 μL，立即加到装有2 mL 0.1% Na2CO3溶液的EP管中，吹打均匀。用分光光度计在600 nm波长处测定吸光度，以0.1 % Na2CO3溶液作为空白对照。将小鼠颈椎脱臼处死之后摘取脾脏和肝脏，称重，记录。按以下公式计算：K=（1gA2-lgA10）/（t10-t2）,α=K1/3×体质量/（脾重+肝重）,注：t2为第1次采血时间2 min；t10为第2次采血时间10 min；A2为t2采血的吸光度，A10为t10采血的吸光度。

1.6.3 血清溶血素水平测定各组小鼠（n=10）第24d给药后，每日每鼠腹腔注射5%绵羊红细胞0.2 mL进行致敏，并继续给药。致敏后6 d，眼球取血，分离血清，取生理盐水稀释100~200倍的血清样品1 mL和10% SRBC 0.5 mL至试管内，再加入10 %豚鼠血清l mL，空白对照管以生理盐水代替血清，同时设半数溶血管，37℃水浴30 min，冰浴终止反应，离心取上清，于540 nm处测吸光度，按照以下公式计算：HC50=（A样品/A50）×稀释倍数，注：A50为半数溶血管吸光度。

1.6.4 血清细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α含量测定各组小鼠摘眼球取血，血液凝固后，4℃下3 000 r/min，离心10 min，吸出上层血清，分装冻存。参照ELISA试剂盒说明操作测定小鼠血清IL-2、IFN-γ和TNF-α含量。

1.7 统计学处理采用SPSS21.0统计学软件进行分析，计量资料以均数值±标准差（±s）表示，多组均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间差异比较采用Student Newman Keuls（SNK）检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对正常生理小鼠和免疫抑制小鼠免疫器官的影响与空白组相比，正常生理水提物各剂量组小鼠脾脏指数明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与空白组相比，模型组小鼠胸腺指数和脾脏指数明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），造模成功。与模型组相比，CTX+醇提物各剂量组和CTX+水提物各剂量组小鼠胸腺指数明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；CTX+醇提物中、高剂量组、CTX+水提物各剂量组小鼠脾脏指数明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；阳性组小鼠胸腺指数和脾脏指数明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 锁阳醇提物和水提物对正常生理小鼠和免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响（n=10，±s）

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

组别空白组模型组阳性组正常生理醇提物高剂量组正常生理醇提物中剂量组正常生理醇提物低剂量组正常生理水提物高剂量组正常生理水提物中剂量组正常生理水提物低剂量组CTX+醇提物高剂量组CTX+醇提物中剂量组CTX+醇提物低剂量组CTX+水提物高剂量组CTX+水提物中剂量组CTX+水提物低剂量组剂量/（g/kg体质量）0.26 0.13 0.065 0.48 0.24 0.12 0.4 0.2 0.1 0.72 0.36 0.18胸腺指数/（mg/g）2.32±0.62 1.03±0.58*3.46±0.33△2.57±0.09 2.52±0.11 2.39±0.24 2.83±0.54 2.71±0.45 2.58±0.29 1.58±0.23△1.43±0.52△1.21±0.18△2.99±0.04△2.48±0.15△2.11±0.24△脾脏指数/（mg/g）5.29±0.32 2.13±0.08*7.87±0.56△5.56±0.13 5.55±0.28 5.39±0.45 7.48±0.68*6.66±0.12*6.49±0.61*3.56±0.68△2.98±0.14△2.37±0.44 5.75±0.24△5.01±0.13△4.19±0.31△

2.2 对正常生理小鼠和免疫抑制小鼠吞噬功能的影响与空白组相比，正常生理水提物各剂量组小鼠廓清指数明显升高作用，差异有统计学意义（P<0.05）。与空白组相比，模型组小鼠廓清指数和吞噬指数明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），造模成功。与模型组相比，CTX+醇提物高剂量组、CTX+水提物中、高剂量组小鼠廓清指数明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；CTX+醇提物高剂量组、CTX+水提物各剂量组小鼠吞噬指数明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；阳性组小鼠廓清指数和吞噬指数明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 锁阳醇提物和水提物对正常生理小鼠和免疫抑制小鼠吞噬功能的影响（n=10，±s）

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

组别空白组模型组阳性组正常生理醇提物高剂量组正常生理醇提物中剂量组正常生理醇提物低剂量组正常生理水提物高剂量组正常生理水提物中剂量组正常生理水提物低剂量组CTX+醇提物高剂量组CTX+醇提物中剂量组CTX+醇提物低剂量组CTX+水提物高剂量组CTX+水提物中剂量组CTX+水提物低剂量组剂量/（g/kg体质量）0.26 0.13 0.065 0.48 0.24 0.12 0.4 0.2 0.1 0.72 0.36 0.18廓清指数K 0.057±0.009 0.036±0.001*0.050±0.004△0.042±0.005 0.039±0.004 0.037±0.008 0.089±0.003*0.069±0.005*0.062±0.010*0.049±0.003△0.044±0.007 0.040±0.005 0.067±0.006△0.057±0.004△0.045±0.009吞噬指数α 7.63±0.85 5.12±0.57*6.78±0.23△5.58±0.12 5.43±0.45 5.29±0.09 7.99±0.21 7.72±0.43 7.68±0.29 6.12±0.29△5.52±0.58 5.34±0.61 7.89±0.45△7.54±0.31△6.36±0.15△

2.3对正常生理小鼠和免疫抑制小鼠血清溶血素水平的影响与空白组相比，正常生理水提物中、高剂量组小鼠HC50明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与空白组相比，模型组小鼠HC50明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），造模成功。与模型组相比，阳性组、CTX+醇提物中、高剂量组、CTX+水提物各剂量组小鼠HC50明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

表3 锁阳醇提物和水提物对正常生理和免疫抑制小鼠HC50的影响（n=10，±s）

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

2.4 对正常生理小鼠和免疫抑制小鼠血清细胞因子含量的影响与空白组相比，正常生理醇提物高剂量组、水提物各剂量组小鼠血清IL-2含量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；正常生理水提物高剂量组小鼠血清IFN-γ含量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；正常生理醇提物中、高剂量组、水提物各剂量组小鼠血清TNF-α明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。与空白组相比，模型组小鼠血清IL-2、IFN-γ和TNF-α含量含量明显减少，差异有统计学意义（P<0.05），造模成功。与模型组相比，CTX+醇提物高剂量组、CTX+水提物中、高剂量组小鼠血清IL-2含量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；CTX+水提物中、高剂量组小鼠血清IFN-γ含量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；CTX+醇提物中、高剂量组、CTX+水提物各剂量组小鼠血清TNF-α含量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；阳性组小鼠血清IL-2、IFN-γ和TNF-α含量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05），见表4。

表4 锁阳醇提物和水提物对正常生理和免疫抑制小鼠IL-2、IFN-γ和TNF-α的影响（n=10，±s）

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

组别空白组模型组阳性组正常生理醇提物高剂量组正常生理醇提物中剂量组正常生理醇提物低剂量组正常生理水提物高剂量组正常生理水提物中剂量组正常生理水提物低剂量组CTX+醇提物高剂量组CTX+醇提物中剂量组CTX+醇提物低剂量组CTX+水提物高剂量组CTX+水提物中剂量组CTX+水提物低剂量组剂量/（g/kg体质量）0.26 0.13 0.065 0.48 0.24 0.12 0.4 0.2 0.1 0.72 0.36 0.18 IL-2/（ng/L）106.79±8.78 44.35±9.46*96.41±10.52△136.24±15.49*110.15±13.28 108.22±13.17 158.74±10.55*144.13±12.43*119.11±9.19*59.34±12.19△50.08±9.42 46.72±8.44 100.08±11.42△78.23±8.27△54.73±12.81 IFN-γ/（ng/L）168.77±12.56 85.28±16.89*147.77±18.73△174.39±16.48 169.14±12.73 166.41±22.15 200.12±18.54*172.46±15.42 169.33±17.29 96.16±23.14 92.45±22.51 88.47±20.43 132.69±13.79△116.47±14.82△100.00+14.29 TNF-α/（ng/L）52.52±8.41 22.34±10.12*49.18±8.74△75.34±11.10*70.27±10.52*60.89±9.98 84.27±9.51*78.13±14.29*71.24±10.38*39.99±11.14△32.54±13.17△23.89±17.21 51.37±9.79△44.59±10.64△29.74±16.55△

3 讨论

环磷酰胺是用于恶性肿瘤的抗癌化疗药物，系常用的免疫抑制剂[11-12]。目前，环磷酰胺诱导的免疫抑制模型已被广泛应用。本实验采用第1~3天腹腔注射80 mg/kg环磷酰胺后1周强化1次的方法建立免疫抑制小鼠模型[13]。结果显示，环磷酰胺使模型组小鼠的免疫脏器指数、吞噬功能、血清溶血素水平、血清细胞因子水平均明显降低，说明造模成功。

脾脏指数和胸腺指数通常用来评价机体的整体免疫状态[14]。本实验结果表明，锁阳醇提物对正常生理小鼠的胸腺和脾脏指数没有明显的影响，锁阳水提物可明显提高正常生理小鼠脾脏指数。锁阳醇提物和水提物均可明显提高免疫抑制小鼠胸腺指数和脾脏指数，高剂量锁阳水提物可以将免疫抑制小鼠胸腺和脾脏恢复到正常水平。巨噬细胞的吞噬功能是免疫系统的重要组成部分，对抗原识别、呈递和免疫应答起着重要作用[15]。本实验结果表明，锁阳醇提物对正常生理小鼠的廓清指数和吞噬指数没有明显的影响；锁阳水提物可明显提高正常生理小鼠的廓清指数。锁阳醇提物和水提物均可明显提高免疫抑制小鼠廓清指数和吞噬指数，高剂量锁阳水提物可将受损的小鼠吞噬功能恢复到正常水平。血清溶血素是反映机体体液免疫水平的重要指标[16]。本实验结果表明，锁阳醇提物不能促进正常生理小鼠血清溶血素抗体的生成；锁阳水提物可明显促进正常生理小鼠血清溶血素抗体的生成。锁阳醇提物和水提物均可明显促进免疫抑制小鼠血清溶血素抗体的生成，高剂量锁阳水提物对血清溶血素抗体生成的促进作用与阳性药物相当。细胞因子通过影响免疫细胞增殖、分化和其它功能来调节机体免疫反应[17]。本实验结果表明，锁阳醇提物可以提高正常生理小鼠和免疫抑制小鼠IL-2和TNF-α分泌水平；锁阳水提物可以提高正常生理小鼠和免疫抑制小鼠IL-2、IFN-γ和TNF-α分泌水平。高剂量锁阳水提物对TNF-α分泌水平的影响与阳性药物相当。

综上所述，锁阳醇提物对正常生理小鼠和免疫抑制小鼠有一定的免疫调节作用，但是与醇提物相比，水提物的免疫调节作用更好，主要表现在：提高胸腺指数和脾脏指数，促进机体发育；增强吞噬功能；促进溶血素抗体的生成，增强体液免疫；提高IL-2、IFN-γ和TNF-α分泌水平，增强细胞免疫。本研究为今后进一步明确锁阳免疫调节活性的物质基础提供了方向和研究基础，为锁阳调节免疫功能保健品的开发和应用提供了实验依据。