非小细胞肺癌中高表达piR-1366的临床病理意义及对肿瘤转移的影响

郭虹 韩微 马怡君 周彩婷 冯康 王磊 史宏灿

1江苏省扬州大学医学院（江苏扬州 225009）；2大连医科大学（辽宁大连 116044）；江苏省扬州大学附属医院3心胸外科，4病理科（江苏扬州 225009）

肺癌是常见的呼吸系统恶性肿瘤，其病死率和复发率位居恶性肿瘤之前列［1］。肺癌最常见的病理类型是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其发病率逐年上升，平均生存期不到6个月［2］。尽管分子医学研究不断进步，但肺癌的治疗效果并没有明显提高。因此，寻找肺癌新的诊断指标和治疗方案显得十分重要和迫切。piRNA是一种具有21～35个核苷酸序列的非编码RNA［3］，与PIWI蛋白结合发挥生物学作用［4-5］。近年来piRNAs的功能研究已成为肿瘤的研究热点，其在恶性肿瘤组织中异常表达，并与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移等密切相关［6-8］。本研究通过NSCLC的piRNA表达谱分析发现piRNA-1366（piR-1366）的表达水平升高，为此本研究探讨高表达水平piR-1366的临床病理意义及对肺癌细胞相关功能的影响，为临床分子诊断和治疗NSCLC提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 87对NSCLC癌组织和邻近正常肺组织来自于2018年1月至2020年12月扬州大学附属医院胸外科手术切除标本，NSCLC由病理医师诊断，即除小细胞癌之外的肺癌，包括了鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等。邻近正常肺组织指的是癌灶周边3 cm以上没有肿瘤细胞的正常肺组织。患者年龄39～76岁，男56例，女31例。本研究已获扬州大学附属医院伦理委员会批准。新鲜标本采集后除小部分立即提取总RNA后，其余组织放入液氮罐里长期保存，以备后期实验所用。收集患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、肿瘤分级及TNM分期、淋巴结转移等临床资料。

1.2 细胞和质粒 NSCLC细胞株（A549和H1650）和正常肺上皮细胞（BEAC-2B）购自北京协和医学大学细胞库。细胞培养在含有10%胎牛血清（FBS）（HyClone公司）、120 IU/mL青霉素和120 mg/mL链霉素的DMEM培养液中，加湿培养箱的温度为37℃，内含5% CO2。piR-1366模拟物/抑制剂相关质粒和阴性对照品（NC）均购自上海生工生物科技有限公司。使用lipofectamine2000试剂（Invitrogen）将相关质粒转染到肺癌细胞中，分为高表达piR-1366（piR-1366）组、敲低piR-1366（si-piR-1366）组和正常对照组（NC）。

1.3 Arraystar piRNA芯片检测肺癌中piRNA表达谱 本研究前，提取5对NSCLC组织和癌旁正常肺组织的总RNA，送至上海AKSOMICS生物科技公司进行人肺癌Arraystar-piRNA表达谱（Arraystar，Rockville，USA）分析，该芯片用于分析23 000个人类piRNA。AKSOMICS公司提供了表达谱和图像采集的数据与分析。依据NSCLC组织和癌旁正常肺组织之间形成的标准化log2比值强度分布、分层聚类分析所显示的上调和下调的表达异常的piRNAs、散点图筛选的显著差异表达的piRNAs（阈值倍数变化≥2.0，P＜0.01），初步筛选出5个上调和5个下调的piRNAs（均P＜0.01），其中piR-1366上调倍数达17.1，在5个上调piRNAs中倍数变化最为明显。因此，选择piR-1366作为本研究的研究对象。

1.4 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR） 使用TRIzol试剂（Invitrogen公司）分离总RNA。RNA的光密度（OD）A260/230比值＞1.8。使用Prime-Script第一链cDNA合成试剂盒（Takara）根据试剂盒说明书，将RNA反向转录成cDNA。按照实时荧光定量试剂盒（Takara）的步骤在Applied Biosystems 7500 PCR仪器上进行qRT-PCR实验。piR-1366上游引物为AGGGGCCCGTGCCTTGGA，下游引物为GCGACGCTTTCCAAGGCA。piRNAs表达的内参为U6，mRNAs表达的内参为GAPDH。根据piR-1366的表达水平将87例NSCLC病例分为高表达组与低表达组：高表达组（qRT-PCR比值高于癌旁正常肺组织）、低表达组（qRT-PCR比值低于癌旁正常肺组织）。

1.5 RNA原位杂交检测piR-1366的表达 87例NSCLC癌组织标本进行RISH实验，原位杂交试剂盒由武汉博士德公司提供，实验步骤按说明书进行。piR-1366探针序列为AGGGGCCCGUGCCUUGGA和ACGGAACCUUUCGCAGCG。

1.6 Transwell实验检测piR-1366对肺癌细胞的迁移的影响 各组肺癌细胞分别用无血清细胞培养液制备成细胞悬液。每个检测样品吸取0.2 mL至Transwell小室的上室内，同时吸取0.6 mL的含胎牛血清的细胞培养液至下室内，置于培养箱内孵育24 h。将小室取出，利用棉签擦掉基质胶以及没穿膜的细胞，用PBS洗涤后添加95%的乙醇固定15 min，用结晶紫染色。以上2个实验随机选择5个视野，在显微镜下统计侵袭或迁移数量，结果取平均值。

1.7 裸鼠肺转移模型 BALB/C-nu/nu裸鼠来源于扬州大学动物实验中心，裸鼠质量23～27 g，5～7周龄，饲养在SPF级动物培养箱里。在肺转移模型中，使用PBS缓冲液将肺癌细胞（5×106）制作悬浮液。从小鼠尾静脉注射肺癌细胞。3～4周后观察癌细胞肺转移的情况。动物研究获得扬州大学动物实验伦理委员会批准。

1.8 统计学方法 计量资料用均数±标准差表示，两组比较用t检验，计数资料比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 piR-1366在NSCLC组织与肺癌细胞株中的表达 RNA原位杂交（RISH）结果（图1A）显示，在NSCLC癌组织中piR-1366表达呈阳性高表达（78/87，96.3%），棕黄色阳性颗粒分布在胞浆中。qRTPCR结果显示NSCLC癌组织中piR-1366的表达水平高于癌旁正常肺组织［（6.47±0.64）vs.（2.72±0.38），P＜0.05］。而在肺癌细胞株（A549和H1650）中piR-1366的表达水平高于正常肺上皮细胞BEAC-2B［（5.28 ± 0.89）vs.（1.74 ± 0.32），（4.31 ± 0.78）vs.（1.74± 0.32），图1B］。

图1 piR-1366在NSCLS组织与肺癌细胞株中的表达Fig.1 Expression of PIR-1366 in NSCLS tissues and lung cancer cell lines

2.2 NSCLC中piR-1366的阳性表达与临床病理参数关系 piR-1366高表达组与低表达组NSCLC淋巴结转移差异有统计学意义（P＜0.05），但年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、肿瘤分级及TNM分期差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

表1 piR-1366的表达与临床病理参数的关系Tab.1 Association between the expression of piR-1366 and clinicopathological parameters 例（%）

2.3 piR-1366促进肺癌细胞迁移和转移 上述实验提示piR-1366与NSCLC癌组织淋巴结转移密切相关，故通过Transwell实验和裸鼠肺转移实验进一步研究piR-1366对肺癌细胞迁移和转移的影响。首先通过qRT-PCR验证过表达或沉默piR-1366的慢病毒载体的有效性（P＜0.05，图2A-B）。Transwell实验结果显示过表达piR-1366促进了A549和H1650细胞的迁移，而沉默表达则阻碍了A549和H1650细胞的迁移（图2C-D），两组差异均有统计学意义（P＜0.05）。在裸鼠肺转移模型中通过小鼠尾静脉注射沉默piR-1366表达（si-piR-1366组）A549细胞和未经处理的正常A549细胞（对照组），结果提示在si-piR-1366组中肺转移癌结节数量少于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，图2E-F）。上述结果表明piR-1366在肺癌的转移中起着癌基因的作用，对癌细胞的迁移和转移有促进作用。

图2 piR-1366促进肺癌细胞的迁移和转移Fig.2 piR-1366 promotes the migration and metastasis of lung cancer cells

3 讨论

肺癌是呼吸系统最常见的癌症，也是癌症死亡的主要原因。在我国肺癌的发病人数约为78.1万/年，死亡人数约为62.6万［9］，其死亡的主要原因在于肺癌的转移、复发和耐药性。近年来随着医学不断发展，靶向药物越来越多，新型生物免疫疗法的综合应用，肺癌患者的生存期和预后得到了改善［10-11］。

piRNAs是一种非编码RNA，piR-1366是其中之一，长度为24 nt。肿瘤细胞的基因和表型改变受到小分子piRNAs调控［12］。例如，在乳腺癌中piR-651高表达［13］、在膀胱癌中 piR-594040高表达［14］，体现它们具有促癌作用；在胃癌中piR-823的表达下调，且与胃癌的分期呈正相关［15］。LAW等［16］报道piR-hep1水平与肝癌细胞的侵袭转移呈正相关。QI等［17］研究结果表明piR-19166靶向CTTN基因，抑制前列腺癌细胞的侵袭和远处转移，是前列腺癌早期诊断和治疗的新标志物。因此，笔者就piR-1366对NSCLC发生发展的影响和作用展开研究。

本研究通过RISH得出piR-1366呈阳性表达；qRT-PCR检测发现piR-1366在非小细胞肺癌组织和肺癌细胞株中表达水平升高，在NSCLC淋巴结转移组中其表达水平更高，说明在NSCLC的发生发展中piR-1366起到促癌基因的作用并可能与淋巴结转移有相关性。在分析piR-1366表达与患者的临床病理参数的关系时出现高表达水平的piR-1366与低表达组淋巴结转移比较有明显差异，说明piR-1366表达水平越高，肺癌越容易转移，所以其也可能作为预后判定的一个重要的指标。同样，Transwell实验和裸鼠肺转移实验结果表明piR-1366能促进肺癌细胞的迁移和转移，而敲低piR-1366表达后可减少肺转移瘤的发生，这一结果说明piR-1366对癌细胞的迁移和转移有促进作用，敲低piR-1366表达后可减少肺转移瘤的发生，说明piR-1366可能是转移性NSCLC的生物标志物，未来可能以此开发治疗NSCLC的靶向药物。

本实验的不足之处在于目前只是在功能上对piR-1366进行一些研究，没有在生物学信息方面分析piR-1366的靶基因。而且也没有研究piR-1366对转移作用的具体调控机制，存在一定的局限性，下一步的研究工作将继续探讨piR-1366对转移作用的具体调控机制以及以此为靶点研发靶向药物，为淋巴结转移的肺癌患者提供了一个新的诊断和治疗靶点。

总之，本实验说明piR-1366是一个新的促癌基因，能促进肺癌细胞的迁移和转移，为今后研究piR-1366治疗转移性NSCLC的提供靶向依据。