球孢白僵菌对柑橘木虱内共生菌的影响

戴佳旺， 王会停， 崔施施， 方 元， 徐宏涛， 赖文昶，杨 晨， 李小芳， 李新安， HAFIZA Javaria Ashraf， 王联德*

(1.福建农林大学闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室， 福建福州350002；2.福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室， 福建福州350002)

柑橘木虱(Diaphorina citriKuwayama)，属半翅目(Hemiptera)，木虱科(Psyllide)，为刺吸式口器害虫，成虫和若虫以吸食植物韧皮部汁液直接危害寄主，是柑橘等芸香科植物上的重要害虫。 该虫直接取食柑橘嫩芽、幼叶等部位，造成柑橘幼叶片畸形、干枯脱落等，若虫分泌的蜜露还易引发煤污病(黄建等，1999)。 除直接取食柑橘等芸香科植物造成重大损失外，柑橘木虱还是毁灭性病害柑橘黄龙病的重要传播媒介(Hodkinsonet al，1981)。

目前对柑橘木虱的防治多采用化学防治，但同时也带来了诸多负面问题，而生物农药以其高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性等特性已逐渐引起人们的重视。 球孢白僵菌[Beauveria bassiana(Balsamo)]是一种常见的寄生型虫生真菌，具有寄主范围广、致病性与适应力强等特点，广泛应用于各类农林类害虫的防治(Greenfieldet al，2016；Heskethet al，2010)。

柑橘木虱体内含有多种内共生菌(包括初生内共生菌Carsonella，以及次生内共生菌Wolbachia和Mycetocyte等)，这些内共生菌大多分布在柑橘木虱的肠道内，在柑橘木虱的生长发育、环境适应性和免疫性等中发挥重要作用(马晓芳等，2012)。 徐红星等(2009)发现，柑橘木虱内共生菌可以帮助其抵御寄生蜂的侵染。 Dossiet al(2014)发现柑橘木虱体内Wolbachia的含量会随其虫龄增长而增多，这说明Wolbachia可能在柑橘木虱的生长发育中起到持续的作用。

亚致死效应是指喷施杀虫剂或者虫生真菌后昆虫个体受到一定的毒害却并未致死仍有一定行为能力的现象(Desneuxet al，2007；宋亮，2013)。 有研究表明，虫生真菌对害虫的亚致死效应会影响昆虫的生殖及发育，如球孢白僵菌NJBb2101 菌株亚致死浓度(LC20)使褐飞虱F0和F1代的卵、若虫和成虫的发育历期延长，卵孵化率、若虫和成虫的存活率降低，雌性比率以及单雌产卵量下降等(Wanget al，2018)。

虫生真菌亚致死剂量会影响昆虫的生殖及发育，而昆虫内共生菌同样参与了宿主的生殖发育，为了明确虫生真菌亚致死剂量对昆虫内共生菌的影响，本研究采用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)，检测了球孢白僵菌2 个菌株亚致死浓度处理后，柑橘木虱F1代成虫肠道中内共生菌Wolbachia、Carsonella的变化，研究结果对探明柑橘木虱-内共生菌-虫生真菌三者间的互作具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器试剂 人工气候箱(DGX-330E，宁波赛福试验仪器有限公司)，高压灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，体视显微镜(奥特光学SZ680)，生物显微镜(奥林巴斯CX23)，激光共聚焦显微镜(LeicaSP8)，46.0 g·L-1马铃薯葡萄糖琼脂(potato sucrose agar)培养基(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)，80 mm×120 mm PET 养虫罩(自制)，10 mL 喷壶，50 mL 离心管(市场购买)。

荧光原位杂交试验所需试剂配置如下，0.5 mL 洗涤缓冲液A:400 μL ddH2O＋100 μL SSC 20×＋1 μL 0.1% Tween 20；0.5 mL 洗涤缓冲液 B:450 μL ddH2O＋50 μL SSC 20×；0.5 mL 洗涤缓冲液 C:475 μL ddH2O＋25 μL SSC 20×；1 mL 预杂交缓冲液:800 μL ddH2O＋200 μL SSC 20×＋0.03 g 牛血清蛋白；1 mL 杂交缓冲液:800 μL ddH2O＋200 μL SSC 20×＋1 μL probe。

1.1.2 供试虫源 柑橘木虱采集于福建农林大学闽台作物有害生物生态防控国家重点实验楼前，采集后在实验室饲养3 代以上。 寄主植物为九里香，购买同一批次株高约10 ～15 cm 九里香，将其移栽至小花盆中，定植后用于柑橘木虱饲养。 人工气候箱条件为:温度(28±1)℃，相对湿度(70±10)%，光周期 L ∶D＝14 ∶10。

1.1.3 供试菌株 球孢白僵菌FAFU-12(GenBank ID:MG844429)和 FAFU-16(GenBank ID:MG844431)菌株来自于福建农林大学闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室，供试菌株于4 ℃保存，PDA 培养基培养球孢白僵菌，培养温度(25±1) ℃。

1.2 球孢白僵菌亚致死浓度筛选

1.2.1 球孢白僵菌孢子悬浮液制备 将在PDA 培养基上培养15 d，长势良好的FAFU-12 和FAFU-16 菌株用无菌刀刮下，采用Bamisileet al(2019)所用方法配置1×108conidia·mL-1浓度的孢子悬浮液，而后用 1%的吐温-80 无菌水溶液分别稀释到 1×104、1×105、1×106、1×107conidia·mL-1，共 5 个浓度备用。

1.2.2 球孢白僵菌对柑橘木虱致病力的测定 挑选孵化10 d 左右的柑橘木虱成虫，接至九里香植株上，每株20 头，用锡箔纸覆盖花盆土壤，便于查看试虫的死亡虫体，随后罩上养虫罩，将配制好的不同浓度梯度的球孢白僵菌孢子悬浮液分别喷施到带虫的九里香植株上，每盆植物喷施约10 mL，对照组用1%吐温-80 无菌水溶液进行处理。 每个菌株设5 个浓度，每个浓度设6 个重复。 喷施完毕后将处理过的九里香放入人工气候箱中，饲养条件同上。 从次日开始观察，连续观察7 d，每天记录处理组和对照组中的活虫数。 收集死亡后的柑橘木虱虫体，将其置于铺有2 层湿润滤纸的培养皿中，观察是否有对应虫生真菌的菌丝生长，确保柑橘木虱死亡是由球孢白僵菌所致。

用Excel 2010 软件初步整理试验数据，IBM SPSS Statistics 21 软件统计分析，使用单因素方差分析对校正死亡率进行差异性比较，计算亚致死浓度(LC25)、致死中浓度(LC50)和致死中时间(LT50)。

1.3 荧光原位杂交处理

1.3.1 设计荧光探针 根据柑橘木虱内共生菌Wolbachia、Carsonella在NCBI 的16S rRNA 序列设计特异性引物，并以Cy5 荧光染料修饰引物的5′，其体内2 种内共生菌的引物序列及荧光染料位点如表1 所示，激发波长为646～662 nm，在激发波长的范围内发出红光。

表1 柑橘木虱2 种内共生菌的引物序列及荧光染料位点Table 1 Primer sequences and fluorescent dye sites of the three endosymbionts of D. citri

1.3.2 球孢白僵菌亚致死剂量处理 根据得出的亚致死浓度(LC25)，配置2 菌株孢子悬浮液备用。 挑选羽化后10 d 左右的柑橘木虱成虫，接至已准备好的具有嫩梢的九里香上，每盆植物喷施10 mL 虫生真菌亚致死浓度菌液。 每个处理设6 个重复，每个重复40 头，喷施完成后置于人工气候箱中饲养。 处理7 d 后挑出每个处理中存活的柑橘木虱，将其转移到新的九里香植株上，置于人工气候箱中饲养，在显微镜下观察柑橘木虱产卵情况，24 h 后移除成虫，定期管理直至卵发育为成虫。

1.3.3 柑橘木虱肠道解剖及荧光原位杂交处理 从各处理的柑橘木虱F1代成虫中挑选羽化后10 d 左右的成虫90 头，将试虫用75%的酒精浸泡处理1 min，再用无菌水进行清洗，而后将试虫置于含有磷酸盐缓冲液的培养皿中进行解剖，将解剖出完整的柑橘木虱肠道置于含200 μL磷酸盐缓冲液(PBS)的离心管中，放置2 h 之后进行下一步处理。 将试虫肠道用PBS漂洗3 次(每次500 μL)，漂洗后放入100 ℃的恒温水浴锅中加热15 min，加热结束后再使用PBS 漂洗各管中样品3 次，吸去多余的PBS 溶液，并向离心管中加入20 μL 预杂交缓冲液，随后将其放入37 ℃的干式恒温器中预杂交20 min。 而后将试虫肠道放入含1 mL 杂交缓冲液的离心管(2 mL)中，在避光的环境下分别加入对应的杂交探针，使用锡箔纸包住各管并放入37 ℃干式恒温器中预杂交1 h 以上，杂交结束后取出样本，在避光条件下分别使用洗涤缓冲液A、B、C 漂洗样本(每次每管500 mL)。 玻片制作，用一滴甘油将样本固定在载玻片上，在显微镜下调整好样本的形状后，盖上盖玻片。 最后，使用激光共聚焦显微镜观察样本并保存照片。

1.3.4 分析方法 参考Mannet al(2018)方法将柑橘木虱的肠道划分为过滤腔、中肠、马氏管和后肠4 个部分，根据试验结果所得图片对处理组和对照组2 种内共生菌变化进行分析，2 种内共生菌(Wolbachia、Carsonella)均以红色荧光形式显示。

2 结果与分析

2.1 球孢白僵菌对柑橘木虱亚致死浓度的筛选

喷施球孢白僵菌 2 菌株 7 d 后，FAFU-12 菌株 5 个浓度(1×104～1×108conidia/mL)均显著降低了柑橘木虱的存活率(F5，18＝ 132.65 ，P＝0.000 1)；FAFU-16 菌株除 1×104conidia·mL-1浓度外，其余浓度也均显著降低了柑橘木虱的存活率(F5，18＝ 76.63 ，P＝ 0.000 1)(表 2)。 2 个菌株对柑橘木虱的致病力随浓度的升高而增加，随喷施时间延长死亡率不断上升，喷施浓度为1×108conidia·mL-1时死亡率最高，死亡率分别为87.15%和83.18%。 球孢白僵菌2 菌株对柑橘木虱的致死中时间(LT50)分别为3.23 和4.04 d，FAFU-12 菌株LT50相对较短(表3)。 由致病力参数计算得出，喷施7 d 后球孢白僵菌 FAFU-12 和FAFU-16 菌株的亚致死浓度(LC25)分别为 1.60 × 104和 4.89 × 104conidia·mL-1， 致 死 中 浓 度 (LC50) 分 别 为 7.46 × 105和21.10×105conidia·mL-1(表4)，这说明 FAFU-12 菌株致病力大于 FAFU-16 菌株。

表2 球孢白僵菌对柑橘木虱的校正死亡率Table 2 Corrected mortality of B. bassiana against D. citri

表3 球孢白僵菌(1×108 conidia·mL-1)对柑橘木虱的致死中时间Table 3 The median lethal time of B. bassiana (1×108 conidia·mL-1) against D. citri

表4 球孢白僵菌对柑橘木虱的亚致死浓度和致死中浓度Table 4 Sublethal and median lethal concentrations of B. bassiana against D. citri

2.2 球孢白僵菌亚致死浓度对柑橘木虱肠道中Wolbachia 的影响

对照组(CK)F1代柑橘木虱肠道内Wolbachia主要分布于马氏管、中肠、过滤腔和后肠，且红色荧光强度较高，表明其分布广泛，含量较高，明场通道红色荧光分布范围与荧光通道的结果相对应，表明试验结果真实可信(图1)。 与对照组相比，FAFU-12 菌株的亚致死浓度处理后，F1代柑橘木虱肠道内Wolbachia主要分布在马氏管和中肠处的荧光强度显著减弱，表明红色荧光分布范围减少；FAFU-16 菌株的亚致死浓度处理后，中肠的荧光强度减弱了。 可见这2株菌株的亚致死浓度均可影响F1代柑橘木虱肠道内的Wolbachia，且FAFU-12 菌株的亚致死浓度对F1代柑橘木虱肠道内Wolbachia的影响大于FAFU-16 菌株。

图1 球孢白僵菌亚致死浓度处理柑橘木虱后F1 代肠道内Wolbachia 的分布Figure 1 The distribution of Wolbachia in the intestines of the F1 generation after the treatment of D. citri by B. bassiana LC25

2.3 球孢白僵菌亚致死浓度对柑橘木虱肠道中Carsonella 的影响

对照组(CK)F1代柑橘木虱肠道内Carsonella主要分布于中肠、后肠和马氏管，明场通道结果与相应的荧光通道结果一致，表明试验结果真实可信(图2)。 与对照组相比，FAFU-12 菌株亚致死浓度处理后，柑橘木虱F1代肠道内Carsonella主要分布在中肠、后肠和过滤腔，马氏管中未检测到红色荧光；FAFU-16 菌株亚致死浓度处理后， F1代柑橘木虱肠道内Carsonella主要分布于中肠、后肠和过滤腔，与对照组相比，Carsonella分布发生了变化。

图2 球孢白僵菌亚致死浓度处理柑橘木虱后F1 代肠道内Carsonella 的分布Figure 2 The distribution of Carsonella in the intestines of the F1 generation after the treatment of D. citri by B. bassiana LC25

3 结论与讨论

本研究采用生物测定法测定了球孢白僵菌 FAFU-12 和FAFU-16 菌株对柑橘木虱的致病力，包括校正死亡率、LC25、LC50、LT50以及各个菌株的时间-浓度-死亡率曲线，为虫生真菌对柑橘木虱的生物防控提供了理论依据。

采用FISH 技术检测了球孢白僵菌的亚致死浓度对F1代柑橘木虱成虫肠道内Wolbachia、Carsonella的影响。 在对照组中，Wolbachia在F1代柑橘木虱肠道内分布广泛，主要包括马氏管、中肠、过滤腔和后肠，且荧光强度较高，这一观察结果与Mannet al(2018)和马晓芳等(2012)研究结果一致；Carsonella主要分布在F1代柑橘木虱肠道内的中肠、后肠和马氏管中。球孢白僵菌2 个菌株亚致死浓度处理后，Wolbachia的分布区域明显减少，荧光信号强度减弱；肠道中Carsonella的分布区域虽然变化不大，但荧光信号强度明显减弱。 这些结果表明球孢白僵菌亚致死浓度对2 种内共生菌均有影响，表现为减少了内共生菌在肠道中的分布与含量，其中对Wolbachia的影响大于Carsonella，且与菌株的致病力呈负相关，即致病力越强内共生菌分布越少、含量越低。

内共生菌Wolbachia是迄今为止已知最为广泛存在的胞内的共生菌之一，大约有16%的昆虫感染了这种细菌，参与昆虫的多种重要功能，如为昆虫宿主提供必要的营养，增强宿主昆虫的适应性和对 RNA 病毒的抵抗力等(Werrenet al，2008；Teixeiraet al，2008；Engelstdteret al，2009；Hosokawaet al，2010)。 在本研究中，当使用虫生真菌亚致死浓度进行处理后， F1代柑橘木虱肠道内2 种内共生菌中Wolbachia分布和含量降低最为显著，也证明了当柑橘木虱受到外界侵染时，宿主体内Wolbachia在这种应急反应中的作用；球孢白僵菌侵染柑橘木虱同样显著降低了寄主F1代肠道中Carsonella的含量。 中肠是昆虫消化系统中非常重要的一环，可以帮助昆虫消化食物和吸收营养，和人体胃的作用相似(王晓容，2000)，位于柑橘木虱肠道中的Carsonella，也具有为宿主合成生长发育所需营养物质的功能(Douglas，1989；Meyeret al，2008)；当虫生真菌侵染柑橘木虱时，大量摄取寄主体内营养物质和水分供菌丝生长繁殖，致使寄主代谢紊乱，最终导致寄主死亡(Gillespieet al，2000)。 以上结论表明，柑橘木虱F1代肠道内Wolbachia、Carsonella均参与了虫生真菌与宿主的互作。 虫生真菌侵染柑橘木虱后，通过影柑橘木虱体内的共生菌的含量和分布来消弱其免疫作用。 寄主体内的共生菌能帮助寄主抵御外界病原微生物的侵染(Teixeiraet al，2008)，所以，内共生菌在虫生真菌-柑橘木虱的侵染和免疫的Army-race(军备竞赛)中起到一个帮助寄主抵御外界病原微生物侵染的作用。