维生素B12联合鼠神经生长因子对脑瘫幼鼠智力的改善作用及机制研究

韩欣，丁晓玲，包蕊，王馨，余涛

脑瘫是一类中枢神经障碍综合征，病人主要有运动障碍和智力低下表现。流行病学资料显示［1］，我国脑瘫病儿发病率较高，约为5.5%～7.8%，位居世界前列。脑瘫可给家庭和社会造成沉重的负担，对病人也有长远、严重的影响［2］。鼠神经生长因子（MNGF）属于一种脑神经营养药物，在脑瘫病儿中常用，且有一定效果［3］；维生素B12（VB12）则可促进脑神经发育，促使婴幼儿中枢神经系统正常发展，且既往有研究证实缺乏VB12是神经系统疾病发生的危险因素［4-5］。基于此，2018年1—4月进行本研究，尝试将两者联用于脑瘫幼鼠中，期待能增强疗效。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物72只Wistar大鼠，体质量范围10～20 g，体质量（15.23±2.12）g，2周龄，雌性36只、雄性36只，清洁级，购自上海凯学生物科技公司，许可证号为SCXK（沪）2020-0211。饲养环境与条件：25～27℃、30%～55%相对湿度、光照和黑暗各12 h交替、分笼饲养、标准饲料、自由进食饮水。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.1.2主要试剂及仪器VB12注射液购自新乡市常乐制药有限责任公司；MNGF注射液购自未名生物医药有限公司；原位末端凋亡法（TUNEL）试剂盒购自美国Roche公司；兔抗鼠天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白前酶-3（Pro-Caspase3）、脑组织天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase3）单克隆抗体（一抗，放大倍数为1∶1 000）、山羊抗兔Pro-Caspase3、Caspase3多克隆抗体（二抗，放大倍数为1∶10 000）均购自美国Santa Cruz公司。

XR-XY1032型Y迷宫购自上海欣软信息科技有限公司；XBS-03S型密闭缺氧箱购自杭州艾普仪器设备有限公司；CX41-12C02型光学显微镜购自日本Olympus公司；JYH27020型电泳仪购自北京中慧天诚科技有限公司；MICROPLUSER型电转仪购自美国Bio-rad公司；JS-680D型凝胶成像分析系统购自上海迪图生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1造模系统随机抽样法取48只建模，余24只按系统随机抽样分为假手术组和对照组。具体：取建模幼鼠，乙醚吸入麻醉并固定。消毒颈部皮肤，切开左侧皮肤暴露颈动脉并用0号丝线结扎，缝合皮肤切口，预防感染，并将其置于恒温水浴容器中37℃、2 h。然后置于密闭缺氧箱，通入氧气与氮气混合气体，两者体积分数分别为8%、92%，速度1 L∕min，时间2 h。将Longa评分为2～3分者记为造模成功［6］。假手术组仅做切口左侧颈动脉暴露后缝合，对照组不给予任何干预。将建模成功的大鼠随机分为模型组、VB12组、MNGF组、VB12+MNGF组。

1.2.2配药和给药VB12注射液和MNGF注射液均采用无菌生理盐水配置，终浓度分别为70 mg∕100 mL、2 mg∕100 mL。VB12组神经外膜下注射VB12注射液1 mL∕100 g体质量，MNGF组同法予以MNGF注射液1 mL∕100 g体质量，VB12+MNGF组同法先后给予VB12注射液1 mL∕100 g体质量、MNGF注射液1 mL∕100 g体质量，其余各组均同法予以等量无菌生理盐水，每天1次，维持3周。

1.2.3一般情况观察观察各组饮食、大小便、睡眠、日常活动、体质量等。

1.2.4智力检测给药完成后次日检测，上下午各采用Y迷宫实验测定10次，参数：电压50～60 V，延时5 s。首先适应训练3～5 min，随意变换安全区域。电击大鼠，使其逃到安全区域，打开灯光并持续10～15 s。将此时所在支臂定为正式检测的起始位置，记录正确次数、开灯至逃至安全区所用时间。

1.2.5神经元凋亡指数（AI）检测完成智力检测后处死大鼠，迅速剥取脑皮质以福尔马林溶液固定后脱水、包埋、切片（层厚4 μm）。脱蜡后水化，流动水漂洗。0.1%TritonX100溶液浸泡8 min，流水冲洗后换用PBS缓冲液冲洗。滴加标记混合物50 μL，阴性对照仅滴加稀释液，37℃、60 min。PBS缓冲液冲洗，封片，采用图像分析系统计算神经元AI。

1.2.6蛋白表达检测同上操作获取脑皮质中央前回区组织，采用蛋白免疫印迹法（WB）检测：组织匀浆、裂解后提取总蛋白，上样每孔20 μg，凝胶电泳。转膜120 min，脱脂奶粉封闭2 h。滴加一抗，4℃摇床孵育，次日滴加二抗，常温孵育。2 h后曝光、显影和定影，凝胶成像软件分析Pro-Capase3、Capase3蛋白的相对表达量。

1.3 观察指标观察各组大鼠一般情况、Y迷宫实验正确次数和平均开灯至逃至安全区所用时间，神经元AI，脑组织Pro-Capase3、Capase3蛋白表达。

1.4 统计学方法用SPSS 25.0版检验。计量资料±s采用单因素方差分析和SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般情况变化造模期间共有10只大鼠死亡，余38只大鼠根据系统随机抽样法分为四组，剔除给药期间意外死亡大鼠，模型组余7只、VB12组余9只、MNGF组余8只、VB12+MNGF组余8只，另对照组与假手术组各12只大鼠。对照组大鼠正常饮食、排便，且日常活动正常，精神状态佳，体质量逐渐增长，假手术组手术后精神萎靡、食欲不佳，后逐渐好转并恢复正常。其余四组建模后大鼠均精神萎靡、睡眠较差、活动减少、食欲不佳、体质量下降，VB12组、MNGF组、VB12+MNGF组干预后状态均有所好转，而模型组状态均无好转，且有部分大鼠出现拒食、步态不稳、抽搐等表现。

2.2 Y迷宫实验结果各组幼鼠Y迷宫实验正确次数、平均开灯至逃至安全区所用时间比较均差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组和假手术组比较，模型组正确次数减少，平均开灯至逃至安全区所用时间延长（均P＜0.05）；与模型组比较，VB12组、MNGF组、VB12+MNGF组正确次数均增多，平均开灯至逃至安全区所用时间均缩短（均P＜0.05）。见表1。

表1 各组幼鼠Y迷宫实验结果比较∕±s

表1 各组幼鼠Y迷宫实验结果比较∕±s

注：MNGF为鼠神经生长因子，VB12为维生素B12。①与对照组比较，P＜0.01。②与假手术组比较，P＜0.01。③与模型组比较，P＜0.01。

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2.3 神经元AI与脑组织Pro-Capase3、Capase3蛋白表达比较各组神经元AI比较差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组和假手术组比较，模型组神经元AI升高（P＜0.05）；与模型组比较，VB12组、MNGF组、VB12+MNGF组神经元AI均下降（P＜0.05）。各组脑组织Pro-Caspase3蛋白表达，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。各组脑组织Caspase3蛋白表达比较差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组和假手术组比较，模型组脑组织Caspase3蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，VB12组、MNGF组、VB12+MNGF组脑组织Caspase3蛋白表达均下降（P＜0.05），见图2，表2。

图1 各组幼鼠脑组织Pro-Caspase3蛋白表达检测

图2 各组幼鼠脑组织Caspase3蛋白表达检测

表2 各组幼鼠神经元AI与脑组织Pro-Capase3、Capase3蛋白表达比较∕±s

表2 各组幼鼠神经元AI与脑组织Pro-Capase3、Capase3蛋白表达比较∕±s

注：①与对照组比较，P＜0.01。②与假手术组比较，P＜0.01。③与模型组比较，P＜0.01。

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3 讨论

3.1 本研究的意义VB12对促进婴幼儿智力发展有积极作用，且有报道表明脑瘫病儿的血清VB12水平下降［7］。也有研究选取痉挛性脑瘫病儿采用VB12和MNGF联合治疗发现其效果优于单纯MNGF治疗者，证实VB12可辅助治疗痉挛性脑瘫［8］。MNGF则是维持神经元代谢、促进受损的神经元恢复的必需活性因子，还可促使神经元分化，增强中枢神经系统功能，且有报道显示MNGF可提高脑瘫病儿的智力，增强其日常生活能力，对促进其运动功能恢复也有积极作用［9］。结合上述报道和分析，推测VB12联合MNGF可增强脑瘫疗效，这也是本研究的基础。

3.2 本研究各组一般状况比较分析本研究显示，干预后对照组大鼠一般情况正常，假手术组也逐渐恢复正常，其余四组均精神萎靡、食欲不振，且模型组状态均无好转，甚至部分大鼠出现拒食、步态不稳、抽搐等表现，VB12组、MNGF组、VB12+MNGF组状况在干预后均改善，VB12+MNGF组与假手术组最为接近，提示VB12、MNGF注射均可减轻脑瘫对幼鼠的影响，且两者联合作用更佳。脑瘫可出现脑萎缩、脑室扩大、脑组织软化等病理改变，且脑皮质神经元有不同程度的变性、坏死，脑白质发育障碍，再加上海马区损伤等均可损害智力［10-11］。既往报道证实，VB12缺乏可影响脑神经再生及功能代偿，而补充VB12可增强损伤的脑神经元的自我修复能力，还可促进神经纤维髓鞘化，确保中枢神经网络功能恢复正常［12-13］。此外MNGF可改善智力［14］，结合既往研究归纳其作用机制包括：①MNGF能够上调大鼠梗死区周围和海马区缺血脑组织中脑源性神经营养因子（BDNF）和神经生长因子（NGF），增强受损的神经元的自我修复能力；②MNGF可上调脑损伤新生大鼠海马区脑缺血组织中血管内皮生长因子（VEGF）及神经丝蛋白（NFP）的表达，改善神经功能；③MNGF能够促进脑损伤大鼠突起生长［15-17］。故而VB12联合MNGF对脑瘫幼鼠有显著疗效。

3.3 本研究Y迷宫实验结果比较分析本研究还显示，在正确次数上，四组建模后大鼠均少于对照组和假手术组，且VB12+MNGF组＞MNGF组＞VB12组＞模型组，均差异有统计学意义（P＜0.05）；在平均开灯至逃至安全区所用时间上，四组建模后大鼠均长于对照组和假手术组，且VB12+MNGF组＜MNGF组＜VB12组＜模型组，均差异有统计学意义（P＜0.05），上述结果可知VB12和MNGF均可增强脑瘫幼鼠的智力，且两者联合的作用更佳。

3.4 本研究各组大鼠神经元AI、相关基因与蛋白表达比较分析本研究中还发现，各组大鼠神经元AI差异有统计学意义（P＜0.05），四组建模后大鼠神经元AI均高于对照组和假手术组，且VB12+MNGF组＜MNGF组＜VB12组＜模型组，均差异有统计学意义（P＜0.05），可知脑瘫幼鼠神经元凋亡最严重，给予VB12、MNGF干预后能够减少神经细胞凋亡，而VB12联合MNGF干预的效果更佳。

本研究各组脑组织Pro-Caspase3均相近，而Caspase3蛋白差异有统计学意义（P＜0.05），四组建模后大鼠大脑脑皮质中央前回区组织Capase3蛋白表达均高于对照组和假手术组，且VB12+MNGF组＜MNGF组＜VB12组＜模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），可知VB12、MNGF均可抑制脑瘫幼鼠脑组织Pro-Caspase3的水解程度，下调Caspase3蛋白表达，且VB12联合MNGF的效果均最佳。

Pro-Caspase3是Caspase3蛋白的水解前物质，能够通过蛋白酶解活化，而活化的Caspase3能够将细胞内底物迅速清除，执行凋亡程序［18］。Caspase3是Caspase依赖途径中的关键物质，属于脑损伤后接到神经细胞凋亡的关键，细胞凋亡参与脑性瘫痪的发生和发展，且与神经元凋亡脱氧核糖核苷酸（DNA）的裂解呈同步性。在脑瘫大鼠脑皮质中央前回区组织中，Pro-Caspase3的水解程度较高，因而Caspase3蛋白的表达较高且生物学活性较强，神经细胞凋亡率随之升高［19］。有研究显示，对脑瘫幼鼠给予MNGF腹腔注射能够降低Pro-Capase3的水解程度，下调Caspase3蛋白的表达水平，且还发现神经细胞凋亡率下降［20］。但是关于VB12对Pro-Caspase3水解程度的影响目前尚无相关报道，仍需要进一步观察其影响并探讨其作用机制。结合上述研究结果和分析，推测VB12联合MNGF很可能能够通过抑制脑瘫幼鼠脑皮质中央前回区组织Pro-Caspase3的水解，控制Caspase3蛋白表达水平，抑制神经元凋亡DNA的裂解，促进受损神经元的修复，减轻脑损伤，并通过该途径降低脑瘫大鼠神经元凋亡率，发挥改善脑瘫幼鼠智力的作用，达到治疗目的。

4 总结

综上所述，VB12联合MNGF对脑瘫幼鼠有显著疗效，且可显著减少神经元凋亡，推测与抑制脑组织Pro-Caspase3水解、下调Caspase3蛋白表达有关，两者联合的作用显著优于单独使用。本研究为脑瘫病儿临床治疗中VB12、MNGF联合使用奠定了基础，且明确了其作用机制，为其推广应用提供了参考，对脑瘫病儿的临床治疗有一定的指导意义。本研究仍存在不足：VB12、MNGF治疗脑瘫幼鼠的最佳浓度、两者联合的最佳配比尚不明确，后续应完善分组，细化研究。