环保视角下粪便堆肥用微生物研究方法效果及进展

绵阳师范学院 冀红柳

随着我国国民肉类消耗的增加，畜禽养殖规模扩大带来的粪便污染问题日益严重[1]。畜禽粪便不仅会对海陆空造成污染，同时也会引起畜禽乃至人类的一些疾病[2]。但从资源的角度看待粪便，其中又含有巨大的价值，粪便经合理处理后可作为肥料、饲料及能源等[3]。本文综合阅读近年来关于堆肥微生物研究的文献，对各种方法进行了总结分类，初步总结了目前粪便堆肥微生物的研究方法。

一、粪便堆肥微生物的组成

粪便堆肥的过程分为初期、高温期、降温期，在不同的堆肥时期，各种微生物相互交替演变、繁殖生长，共同作用完成堆肥过程。

（一）细菌

细菌菌群为粪便堆肥整个过程的优势菌群，堆肥初期嗜温细菌为主要菌群，随着温度的上升，细菌菌群也在不断演变。

（二）真菌

真菌对温度很敏感，最适温度在25-30℃，多数真菌为嗜温真菌，比如曲霉和木霉等。

（三）放线菌

放线菌对纤维素、半纤维素有一定的降解能力，在高温下可以孢子形式存活，所以抗逆性比真菌更好。

二、影响粪便堆肥微生物作用效果的主要因素

粪便堆肥进程的速度及效果受微生物的作用影响。微生物的生长繁殖、消耗合成等过程会被很多因素所影响，包括CN、PH值、含水量、通气量、温度等，这些因素可升高或降低微生物合成酶的速度、微生物代谢快慢等。

（一）温度

在粪便的堆肥过程中，温度是一个重要指标。我国《农业废弃物无害化处理标准》规定，需要在55℃条件下持续3天以上或50-55℃条件下5-7天，才能满足无害化处理要求。为了保证堆肥产品的质量，堆体的温度最好维持在45-65℃。

（二）通气量

不论是粪便的好氧堆肥还是厌氧堆肥，通气量都是一个很重要的因素。主要影响两个方面：第一，适当的通气量带走堆体中过多的温度，温度超过68℃会影响嗜热菌群的活性。第二，通气量不达标就会造成厌氧环境，从而影响好氧堆肥进程。

（三）C/N

C/N是堆肥过程中评价堆肥程度的一个重要指标。有机C是微生物生长的重要能量来源，通过微生物作用将粪便中的一些物质转化为CO2和腐殖质。有机N是微生物的营养来源，一部分被微生物吸收作为营养，一部分转化为恶臭气体的主要来源氨气，剩余的绝大部分进行了硝化作用。C/N需要保持一定的比例，有机C过高会导致微生物对堆体降解的时间过长，有机N过高不利于微生物的生长繁殖，同时还会产生大量恶臭气体等。堆肥初始C/N一般保持在20-35。

（四）PH值

在堆肥过程中，认为PH值一般保持为7.0~7.5，这个范围适合微生物的生长繁殖，有利于粪便堆肥的进行。酸性环境可减少N以氨气的形式损失，提高N含量，有利于堆肥产品的质量。

（五）含水量

水是很重要的载体，粪便堆肥微生物所需很多营养物质都需要溶于水才能被分解吸收。含水量不适宜会影响微生物生长代谢繁殖，含水量过高会造成堆肥缝隙被填满以致氧气循环受阻、产生酸臭味，导致养分损失及环境二次污染，含水量不足时会影响微生物对有机物的分解吸收，造成堆体发酵不充分。

三、不同方法对堆肥微生物及其效果的研究现状

（一）传统稀释培养分离法

传统的稀释分离培养是根据需分离培养微生物的性质来选择相应的培养基进行分离培养的，然后用显微镜来观察菌类的形态特征、生理生化特征及数量来研究环境微生物的多样性。

（二）磷脂脂肪酸甲酯法（PLFA）

磷脂脂肪酸作为生物标记，可以定量地分析菌群数量和群落结构，具有应用范围广，适用于土壤、水、腐殖质等微生物中的检测；可迅速处理多种样品；精准测量样品中生物量；避免传统培养分离方法引起的计数不足等问题。但同时此方法也有不足之处，首先，对磷脂脂肪酸的掌握不充分，不能把检测到的数据与微生物对应；其次，无法将生物群落组成与功能相联系；最后，磷脂脂肪酸的合成与微生物的生长繁殖环境密切相关，比如湿度、温度、PH等。

（三）分子生物学技术

研究微生物的多样性一般是直接从环境样品中提取DNA或RNA，然后对其进行PCR扩增再采用多种技术来鉴定比如说变性梯度凝胶电泳 、末端限制性片段长度多态性以及高通量测序等。PCR片段扩增采用的目的片段一般选择相对保守又能区分不同菌群的，例如细菌一般采用16S rRNA，具有的优点为多拷贝、多信息、长度适中等。近些年来分子生物学不断地成熟与发展，加速我们更深层次更全面的了解粪便堆肥微生物。我们希望基于分子生物学来获得粪便堆肥微生物的种类和多样性、特定时间活跃的菌群以及功能及潜在功能。常用的一些技术包括但不限于DGGE、T-RFLP、高通量测序、宏组学、单细胞水平研究等方法。

1.变性梯度凝胶电泳（DGGE）

DGGE是研究微生物采用最早的分子生物学技术，具有分辨率高、成本低、应用方便等优点，缺点是会被DNA的提取、PCR的扩增乃至引物设计等过程影响而测量分析的微生物群落丰度要>1%。

2.末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）

限制性长度多态性（RFLP）是由于粪便堆肥过程中出现的不同微生物种群基因不同，具有各自的限制性酶切位点，利用DNA酶进行酶切后电泳会产生各自相应的条带，可利用这些条带进行群落多样性、结构和重组质进行内切酶酶切后，会出现4-6条片段，增加了鉴定的复杂性，因此这种方法适用于分析微生物群落的不同阶段。为了弥补这些不足，在RFLP基础上对PCR扩增过程中的末端特异性引物进行荧光标记，再进行后续酶切、电泳等操作，即末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）。

3.高通量测序

高通量测序具有通量大、准确率高、操作相对简单等优点，逐渐被广泛应用于环境微生物的检测分析。最常用的方法是利用Illumina Miseq 高通量测序技术对样品的16S rRNA的相关区域分析。采用高通量分析技术，对猪粪高温堆肥的初始阶段、高温阶段、腐熟阶段样品的16S rDNA V4～V5 可变区序列进行测序分析，在升温期和高温期优势门均为厚壁菌门，而腐熟期优势门为放线菌门，该方法准确分析猪粪堆肥过程中微生物群落结构的演替，为堆肥过程添加外源菌剂促进堆肥过程的进行提供了理论依据。

4.宏组学

宏组学是指宏基因组学、宏转录组学及宏蛋白组学等。宏基因组是特定环境样品中的全部基因，这种研究方法的研究对象为真菌和细菌基因组的DNA，解决了环境样品中大部分微生物不能分离培养的难题。宏基因组学无法在特定的环境下表达微生物群落基因的变化，而宏转录组学弥补了这一问题。宏转录组是在特定的环境、时空中微生物全部转录体的总和。

5.单细胞水平研究

我们已经能够从群落水平认识微生物的分类、结构组成等方面，但一直很难从单细胞水平认识群落中的微生物。随着单细胞水平的研究逐渐深入，我们从最初的放射自显影技术（Microautoradiography，MAR） 到 现 如今拉曼光谱学显微技术（Raman spectroscopy，Raman）以及纳米二次离子质 谱（Nano-scale secondary ion mass spectrometry，nanoSIMS)，后两者分辨力非常高，可达到纳米级别。

四、结语

微生物在粪便堆肥及资源化利用过程中有着十分重要的地位。在微生物群落演替，不同菌类的作用效果、发现更加高效的菌类和研制新型外源微生物添加剂，都离不开对微生物的研究。在传统微生物研究方法的基础，随着分子生物学的不断更迭发展，对微生物拥有了更加深层次的认识。另外，在研究过程中我们不能只局限于一种方法，各种方法都有优缺点，应选择合适的研究方法与技术相组合。

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微生物包括：细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，与人类关系密切。涵盖了有益跟有害的众多种类，广泛涉及食品、医药、工农业、环保、体育等诸多领域。在我国教科书中，将微生物划分为以下8大类：细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体。有些微生物是肉眼可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝、香菇等。还有微生物是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”。肉眼难以看清，需要借助光学显微镜或电子显微镜才能观察到的一切微小生物的总称。微生物包括细菌、病毒、真菌和少数藻类等。（但有些微生物是肉眼可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝等。）病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”，但是它的生存必须依赖于活细胞。根据存在的不同环境分为空间微生物、海洋微生物等，按照细胞结构分类分为原核微生物和真核微生物。一个体积恒定的物体，被切割的越小，其相对表面积越大。微生物体积很小，如一个典型的球菌，其体积约1mm³，可是其表面积却很大。这个特征也是赋予微生物其他如代谢快等特性的基础。

相比于大型动物，微生物具有极高的生长繁殖速度。大肠杆菌能够在12.5-20分钟内繁殖1次。不妨计算一下，1个大肠杆菌假设20分钟分裂1次，1小时3次，1昼夜24小时分裂24×3=72次，大概可产生4722366500万亿个（2的72次方），这是非常巨大的数字。但事实上，由于各种条件的限制，如营养缺失、竞争加剧、生存环境恶化等原因，微生物无法完全达到这种指数级增长。 已知大多数微生物生长的最佳pH范围为7.0 (6.6-7.5)附近，部分则低于4.0。