自噬调控巨噬细胞参与构建肿瘤微环境研究进展

高 正，陈佳锋，傅修涛，丁振斌

复旦大学附属中山医院肝脏外科，上海 200032

自噬是生物进化过程中高度保守的细胞活动，通过参与物质循环利用来维持细胞稳态。根据降解物进入溶酶体的方式，将自噬分为3类：巨自噬、微自噬及分子伴侣介导的自噬[1]。肿瘤微环境中广泛存在诱导自噬的因素，包括低氧环境、营养匮乏、内质网应激、ATP/AMP比值下调等。自噬和肿瘤微环境能够相互作用，从而影响肿瘤进展[2]。巨噬细胞作为肿瘤微环境最关键的基质细胞之一，对肿瘤发生发展、转移和治疗起重要作用。本文就自噬通过调控巨噬细胞参与肿瘤微环境构建的机制及意义进行综述。

1 自噬过程概述

经典自噬过程为mTOR和AMPK通过感知能量变化而激活蛋白激酶复合物ULK(Unc-51-Like kinase)，继而通过膜泡分拣蛋白34(vacuolar protein sorting 34，VPS34)促进吞噬泡形成，自噬降解物与接头蛋白SQSTM1/p62结合促进自噬体形成，自噬体进一步与溶酶体融合形成自噬溶酶体后降解胞内物质[3-4]。自噬以形成双层膜自噬体结构为特征，其过程包括自噬体起始、延长、闭合及自噬体与溶酶体融合[5]。起始阶段ULK激酶复合物

活化Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(PI3K)，产生3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)[6]，招募WD重复结构域磷酸肌醇相互作用蛋白2(WIPI2)和双FYVE结构域蛋白1(DFCP1)作为结合蛋白参与自噬体膜的形成[7-8]；随后自噬体通过2个泛素化修饰过程进行延长。其中自噬相关基因5(autophagy-related gene 5，ATG5)与ATG12共价连接后，与ATG16L相互作用形成自噬前体[9]；磷脂酰乙醇胺(PE)与自噬相关蛋白ATG8/LC3结合后，形成膜结合LC3Ⅱ诱导自噬体延长和闭合，最终形成自噬溶酶体[10]。

在分子水平上，PI3K-AKT-mTOR信号通路、AMPK-TSC1/2-mTOR等信号通路参与自噬调控，其中mTOR是自噬负调控的关键分子。AMPK则在胞内低ATP水平时通过磷酸化TSC2抑制mTOR活性，诱导自噬发生。因此胞内ATP水平、缺氧等细胞信号可将自噬整合入肿瘤调控网络，进而影响肿瘤发展。除经典通路外，活化的FOXO可通过PI3K-AKT-FOXO通路以谷氨酰胺合成酶依赖的方式抑制mTOR而诱导自噬[11]。p53则在DNA损伤时通过诱导生成应激诱导蛋白Sestrin激活AMPK，进而活化TSC，抑制mTORC，诱导自噬[12]。此外，紫外线抵抗相关基因(UVRAG)可通过与Beclin-1相互作用活化PI3K，进而提高自噬水平[13]；而Bcl-2与Beclin-1相互作用后则可抑制PI3K的活性，从而降低自噬水平。应激条件下，Bcl-2从Beclin-1/PI3K复合物中分离，打破其与UVRAG间的平衡，进而提高自噬水平[14-15]。

2 巨噬细胞参与构建肿瘤微环境

肿瘤微环境，即肿瘤细胞形成和生存的内环境，包括肿瘤细胞及其周围的免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞等非肿瘤细胞，同时包括细胞间质、微血管及各种生物分子。巨噬细胞作为构建肿瘤微环境的关键免疫细胞参与早期肿瘤形成、进展及转移。肿瘤微环境中，巨噬细胞极化为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)并具有很强的可塑性。根据刺激源的不同，TAMs主要分为2个表型：M1样抗肿瘤表型和M2样促肿瘤表型。其中干扰素-γ(IFN-γ)和脂多糖(LPS)诱导M1型TAMs形成，而白细胞介素4(IL-4)、IL-10等细胞因子则促进M2型TAMs形成。多数研究[16-17]显示，在已形成的肿瘤体系中，M2型TAMs占比较高，高表达CD163、CD206，并分泌抗炎细胞因子、血管生长因子等，从而抑制肿瘤微环境免疫、促进肿瘤血管生成。

肿瘤形成起始阶段，TAMs通过诱导肿瘤微环境炎症反应促使上皮细胞基因稳态失衡，诱发癌变[18]；同时，TAMs通过产生表皮生长因子受体(EGFR)、肿瘤坏死因子(TNF)、IL-6等形成诱变微环境，从而激活肿瘤细胞[19]。在肿瘤进展阶段，TAMs通过分泌多种促血管生成因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)等促进肿瘤微环境血管新生[20]。肿瘤转移则涉及转移前微环境的形成、血管内浸润、循环肿瘤细胞生存、血管外侵出及定植于转移部位等多个步骤。此外，TAMs可分泌多种蛋白降解酶，进而介导肿瘤细胞与胞外基质间的相互作用，通过重建胞外基质促进肿瘤侵袭转移[21]。Wu等[22]研究发现，外泌体介导的M2型TAMs通过表达CD11b/CD18来活化肝癌细胞金属基质蛋白酶9(MMP-9)信号通路，从而诱导肿瘤细胞侵袭和转移。Wei等[23]发现，CD163+TAMs通过调节JAK2/STAT3/miR-506-3P/FoxQ1轴诱导上皮间质转化，从而促进结直肠癌细胞侵犯及转移。肿瘤细胞免疫逃逸是调节肿瘤生长和转移的关键事件，而微环境中的M2型TAMs通过分泌趋化因子(如CCL5、CCL22)招募Treg细胞，同时能分泌IL-10、TGF等，进而抑制T细胞免疫反应[24]。

3 自噬调控肿瘤微环境

肿瘤细胞与非肿瘤细胞以自噬为媒介对肿瘤微环境产生影响[25]。有研究[26]显示，肿瘤细胞自噬可以调节程序性死亡受体配体-1(PD-L1)表达，进而逃避微环境中免疫细胞的杀伤，促进免疫逃逸。Yamamoto等[27]也发现，胰腺导管癌细胞表面表达的主要组织相容性复合物Ⅰ(MHC-Ⅰ)可被NBR1介导的选择性自噬所降解，并导致免疫逃逸。此外，乏氧环境中的肿瘤细胞可通过自噬降解缝隙连接蛋白43，抑制黑素瘤细胞与自然杀伤细胞间免疫突触的形成，进而抑制自然杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤作用[28]。同时，肿瘤细胞可形成自噬泡，通过包裹和吞噬细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞所分泌的细胞毒性分子颗粒酶B，从而抵抗其细胞毒性作用[29]。

非肿瘤细胞也可通过自噬以不同方式作用于肿瘤细胞。New等[30]发现，肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)自噬激活后，可分泌细胞因子IL-6、IL-8等，进而促进肿瘤侵犯和转移。同时肿瘤细胞通过旁分泌IL-6、IL-8进一步提高CAFs自噬水平，进而在肿瘤微环境中形成自噬反馈环路。Sousa等[31]发现，在胰腺肿瘤微环境中，胰腺星形细胞以自噬性蛋白分解的方式产生丙氨酸，之后丙氨酸被肿瘤细胞摄取，为肿瘤生长提供可替代性碳源。而常规来源的碳(如葡萄糖)则用于更重要的生物合成过程，如产生丝氨酸和甘氨酸以保障肿瘤细胞核酸合成。内皮细胞自噬也可参与肿瘤血管生成。肿瘤基质中透明质酸合成酶2(HAS2)促进透明质酸沉积是肿瘤血管生成和肿瘤转移的重要条件。Chen等[32]的研究表明，通过血管生成抑制剂抑制mTOR提高自噬水平，可诱导内皮细胞内HAS2的自噬性降解，降低基质中透明质酸水平，从而发挥抗肿瘤血管生成效应。

4 自噬调控巨噬细胞与肿瘤微环境间的相互作用

4.1 自噬可通过介导巨噬细胞极化构建肿瘤微环境 在肿瘤微环境中，巨噬细胞极化为M2型TAMs后调节炎症微环境和肿瘤免疫反应是其发挥促肿瘤效应的关键环节，自噬则是介导巨噬细胞极化不可或缺的重要条件。Wen等[26]发现，肿瘤细胞来源自噬小体(TRAPs)通过Toll样受体4(TLR4)介导的MyD88-p38-STAT3信号通路诱导巨噬细胞向M2型TAMs转化，此外TRAPs能以TLR4-MyD88依赖的方式介导巨噬细胞免疫抑制功能；TRAPs通过抑制p38活化，降低STAT3磷酸化水平，诱导TAMs表达PD-L1、IL-10和CD163，同时抑制TAMs表达人类白细胞抗原-DR(HLA-DR)，从而促进肿瘤细胞免疫逃逸。这些结果表明肿瘤细胞能以分泌自噬小体的方式，诱导巨噬细胞向M2表型极化，形成免疫抑制的肿瘤微环境。

肝肿瘤来源的TLR2相关配体能以选择性自噬的方式，调控NF-κB RELA/p65蛋白稳态，从而刺激TAMs向M2型极化[33]。Shiau等[34]发现，肝肿瘤来源的高迁移率族蛋白B1(HMGB1)通过TLR2受体活化NADPH氧化酶2(NOX2)，刺激活性氧类(ROS)以NOX2依赖的方式生成，并提高巨噬细胞自噬水平，之后泛素化的NF-κB相关细胞溶质通过SQSTM1/p62介导的选择性自噬作用被降解，促使巨噬细胞向M2型TAMs极化，形成抑制性肿瘤微环境。上述结果表明抑制自噬，提高NF-κB活性或许可减少巨噬细胞向M2型TAMs极化。

此外，Yang等[35]发现，TAMs内组织蛋白酶S(Cat S)缺乏可导致巨噬细胞内自噬体形成增加、降解减少，从而降低TAMs的自噬通量，同时抑制巨噬细胞向M2型TAMs极化；用氯喹抑制野生型和Cat S-/-巨噬细胞自噬后发现，与结直肠癌细胞共培养的野生型巨噬细胞有精氨酸酶1、IL-10等M2表型特异性基因表达增加，而Cat S-/-巨噬细胞无相应变化。这些证据表明，Cat S介导的自噬通量降低是诱导TAMs向M2型极化，进而导致肿瘤发生的重要机制。

4.2 自噬通过与代谢相互作用调控巨噬细胞影响微环境 自噬作为一种胞内物质降解途径，与细胞内代谢过程存在着广泛联系。尤其在肿瘤细胞高代谢状态，肿瘤微环境营养匮乏的背景下，TAMs需要通过自噬和代谢重编程为其在微环境内的生存提供支持。高水平线粒体自噬和氨基酸代谢可支持巨噬细胞在肿瘤微环境中生存。Xia等[36]发现，T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子4阳性TAMs(Tim-4+TAMs)内，精氨酸酶1可通过将精氨酸转化为下游代谢物，包括鸟氨酸和尿素等，控制巨噬细胞内精氨酸水平；mTOR则通过感知精氨酸及其代谢物水平，使其自身活化，调控Tim-4+TAMs内线粒体自噬水平，降解损伤线粒体，清除ROS，从而避免卵巢癌微环境中的巨噬细胞死亡，促进肿瘤进展。

此外，自噬可通过参与巨噬细胞脂肪酸氧化支持巨噬细胞向M2表型极化。Dai等[37]的研究表明，肿瘤微环境中发生氧化应激能够诱导胰腺导管癌细胞发生自噬依赖性铁死亡，死亡的肿瘤细胞释放KRASG12D，并与巨噬细胞晚期糖基化终产物受体结合，通过活化STAT3而上调肉毒碱棕榈酰转移酶1A和中链酰基辅酶 A 脱氢酶的活性，进一步促进脂肪酸氧化，从而驱动巨噬细胞向M2型TAMs转化。

肿瘤微环境有限的氧供和营养物质促使巨噬细胞通过代谢重编程维系自身存活。自噬作为构建肿瘤微环境和促进巨噬细胞向M2型极化的关键因素，通过参与多种代谢过程，如糖酵解、氨基酸代谢、脂质代谢及核酸代谢，使巨噬细胞代谢重编程有较高的可塑性。然而，自噬与代谢相互作用调控巨噬细胞影响肿瘤微环境的具体分子机制仍未阐释清楚，同时不同类型实体瘤微环境内自噬激活的巨噬细胞代谢谱与正常巨噬细胞的不同之处也有待进一步明确。

4.3 自噬通过促进巨噬细胞吞噬作用影响肿瘤微环境 作为肿瘤微环境的关键免疫细胞，成熟巨噬细胞在微环境内经活化后能有效发挥其抗肿瘤效应。诱导肿瘤细胞自噬能够活化巨噬细胞，并提高其对微环境内肿瘤细胞的吞噬能力。Yang等[38]研究发现，IFN-γ通过上调吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)增加色氨酸的消耗及其代谢产物犬尿氨酸的积累，促使宫颈癌细胞自噬水平升高。共培养自噬激活的宫颈癌细胞和巨噬细胞可诱导巨噬细胞CD80、CD86或CD163表达升高，同时巨噬细胞对自噬活跃的肿瘤细胞吞噬能力增强，表明IFN-γ可通过IDO1-犬尿氨酸-自噬通路促进巨噬细胞活化，提高巨噬细胞吞噬能力，从而抑制肿瘤进展。

Zhang等[39]发现，CD47靶向融合蛋白SIRPαD1-Fc通过抑制CD47-SIRPα通路促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬及细胞毒活性。同时，SIRPαD1-Fc也会触发细胞保护性自噬机制。经SIRPαD1-Fc处理后，肿瘤细胞ROS生成增加，AKT-mTOR信号通路失活，从而提高肿瘤细胞自噬水平，抵抗SIRPαD1-Fc的肿瘤杀伤作用。降低自噬核心蛋白(如ATG5)表达，抑制经SIRPαD1-Fc处理的肿瘤细胞自噬则可进一步提高巨噬细胞介导的吞噬和细胞毒作用。此外，同时靶向自噬和CD47能招募更多巨噬细胞到达肿瘤位点发挥吞噬作用。

由此推测，自噬影响巨噬细胞吞噬和细胞毒作用、抑制肿瘤微环境的促癌效应。但上述研究均未深入探讨自噬影响巨噬细胞吞噬和细胞毒作用所涉及的具体分子通路和调控位点。未来应基于单细胞测序等技术，从基因组、转录组和蛋白质组等水平探寻自噬调控巨噬细胞吞噬和细胞毒作用的基因位点及具体分子机制。

4.4 靶向自噬发挥抗肿瘤效应 鉴于自噬对巨噬细胞的调控及其与肿瘤微环境间的相互作用，以及自噬在低氧、营养匮乏的微环境中是维系肿瘤生存及产生耐药性的重要机制，靶向自噬，增强或抑制其对微环境内巨噬细胞和肿瘤细胞的调控作用或许可起到抗肿瘤效应。

目前一般认为抑制自噬应作为肿瘤治疗的主流方式。Guo等[40]研究发现，通过氯喹抑制自噬可诱导M2型TAMs向M1型转化，实现TAMs复极化。复极化的TAMs 对肿瘤细胞的吞噬能力更强，同时可恢复肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。Tan等[41]发现，黄芩苷可促进M2型TAMs内SQSTM1/p62介导的肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)自噬性降解，促使IKKα活性增强，活化RelB/p52通路，诱导TAMs复极化。此外，Fu等[42]研究表明，TAMs可激活肝癌细胞自噬并抵抗奥沙利铂的肿瘤细胞杀伤作用，敲除自噬基因ATG5则可增强奥沙利铂的细胞毒作用。因此，细胞毒性药物联合自噬抑制剂或许能更好地发挥抗肿瘤效应。

然而，有学者提出，激活自噬同样能发挥抗肿瘤效应。Wang等[43]发现，用于肿瘤治疗的人重组精氨酸酶1(rhArg1)能通过下调微环境内巨噬细胞的自噬水平而诱导其免疫抑制功能；反之，激活自噬则能改善rhArg1诱导的巨噬细胞免疫抑制功能，而活化免疫杀伤效能。因此，选择抑制还是激活自噬调控巨噬细胞对于肿瘤预后和化疗疗效具有重要影响。

综上所述，自噬作为参与调节多个生物学过程的重要机制，在肿瘤发生发展过程中扮演重要角色。同时巨噬细胞作为微环境中重要的非肿瘤细胞，通过极化为M2型TAMs在促进肿瘤侵犯、转移、血管生成等方面起重要作用，同时可发挥免疫抑制功能。自噬能调控巨噬细胞与肿瘤微环境间的相互作用，但详细机制仍缺乏深入研究，如自噬是直接作为巨噬细胞极化、代谢和吞噬等过程的一部分，还是通过调节巨噬细胞极化、代谢及吞噬过程中关键蛋白的生成或降解，从而调控肿瘤微环境都尚未明确。此外，自噬调控巨噬细胞在肿瘤不同时期发挥抑癌还是促癌作用也尚无定论，同时如何进行针对性治疗也值得进一步探讨。因此，未来研究应着重在分子层面阐释自噬通过调控巨噬细胞构建肿瘤微环境的机制，基于测序平台联合多组学(如基因组学、转录组学、蛋白质组学)筛选自噬调控巨噬细胞的基因位点，揭示自噬调控巨噬细胞的分子分类，同时将其运用于临床实践，进而构建新型预后和治疗分层模型，或制定与化疗药物、分子靶向药物联合应用的具体方案，从而为肿瘤治疗提供新思路。