间充质干细胞源性外泌体在肝脏疾病中的研究进展

李 梨

(重庆医科大学附属第二医院 重庆 400010)

间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一种来源于中胚层的、早期未分化的细胞，广泛地分布于人体各个细胞组织中，可实现自我复制、自我更新和无限增殖，还具有实现多向细胞分化的巨大潜能[1]。MSCs可通过分泌细胞因子等方式来调节细胞凋亡、促进干细胞增殖和调节免疫，进而实现组织器官修复。先前的研究表明，间充质干细胞对血液系统疾病、血管性疾病、糖尿病、自身免疫性疾病、退行性疾病、肿瘤性疾病、移植物抗宿主病的治疗具有潜在价值[2][3][4]。

外泌体（exosomes）是一种圆形或椭圆形的膜性囊泡结构，直径约为30～150nm，富含脂质、蛋白质/多肽、mRNA、microRNA(miRNA)、长链非编码RNA以及完整的细胞器等多种成分[5]。外泌体广泛存在于人体尿液、血浆、唾液、母乳、脑脊液、羊水、腹腔积液等多种不同体液中，由造血/非造血细胞产生和释放，包括血小板、网织红细胞、淋巴细胞、肥大细胞、胃肠黏膜上皮的白细胞、树突状上皮细胞、肿瘤细胞、神经系统免疫细胞等[6]。外泌体包括9769种来源蛋白质，3408种mrnas及838种microrna(mirnas/mirs)[7]，参与了机体中许多重要的生理生化过程，在细胞通信、迁移、血管新生、自身免疫反应及恶性肿瘤细胞的生长中都起着重要作用[8][9]。

间充质干细胞源性外泌体（MSCs-exo）与MSCs的功能相似，具有修复组织、组织再生、抑制炎症反应及调节免疫等功能，可用于治疗心脏、肾脏、肝脏、免疫和神经系统疾病[5][10][11]。不同组织来源的MSCs-exo具有不同的作用，骨髓间充质干细胞源性外泌体可应用于减轻心肌缺血、抑制肝脏分化、抗肿瘤、促进皮肤愈合、促进受损肾神经的修复等多种疾病的动物模型[10]。人脐带间充质干细胞源性外泌体可以表达外泌体标志性蛋白CD9及CD63，能够通过上调Treg和下调Th17参与自身免疫功能调节[12][13]。

肝脏被认为是我们身体最大的以其代谢和消化功能活动为主的一种实质性器官,具有储存肝糖、生物转化、合成分泌性蛋白、合成凝血因子、内分泌及免疫调节等功能。急性肝衰竭、肝硬化甚至肝癌等急慢性肝脏疾病严重影响人们的生命健康，提高肝脏在受伤后的修复能力是近年来研究的热门话题。本文将对间充质干细胞源性外泌体对肝脏病变的影响进行综述。

一、间充质干细胞源性外泌体与急性肝损伤

急性肝衰竭（ALF）是一种死亡率极高的疾病，其特征表现是“炎症因子风暴”，通过TNF-α、IL-1和IL-6等促炎因子的释放，从而引起全身炎症反应，最终引起多器官功能衰竭[14]。受损的细胞可产生多种炎性刺激物，导致caspase-1激活，活化的caspase-1剪切并激活pro-IL-1b，最终导致蛋白水解活化；此外，肝细胞损伤后，促凋亡蛋白Bax和caspase3表达上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调[15][16]。Zhao, Liu等[17]通过建立一个D-半乳糖胺和脂多糖（D-GalN/LPS）诱导的肝细胞损伤和凋亡的模型，发现经过BMSC-Exos处理后，Bax和caspase-3的表达水平显著降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平明显上调。但是，当存在自噬抑制剂3MA时，BMSC-Exos对细胞凋亡的抑制作用会发生比较明显的逆转。结果表明，BMSC-Exos可以诱导自噬，并通过介导自噬保护肝细胞免受各种应激损伤。另一项研究使用LPS/D-GalN诱导的小鼠作为ALF的模型[12]。在LPS/D-GalN模型中，D-GalN具有肝毒性作用，而LPS通常与Toll样受体4（TLR4）/CD14复合物结合，从而诱导炎性细胞因子的表达，引起大量巨噬细胞的浸润。结果显示hUC MSC-Exos降低了LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1b和IL-6的表达。由此得出hUC MSC-Exos可降低NLRP3炎症小体的过度活化，在急性肝衰竭小鼠模型中起保护作用。Shao, Xu等[18]通过使用IL-6刺激hUC-MSCs，并对hUC-MSC来源的外泌体进行深度测序，确定miR-455-3p在IL-6刺激下由hUC MSC-Exos分泌产生，通过靶向PIK3r1抑制巨噬细胞释放IL-6和其他炎症因子。在化学性肝损伤小鼠模型中，miR-455-3p的高表达可减轻巨噬细胞浸润和局部肝损伤，降低血清炎症因子水平，从而改善肝脏组织病理损伤。有研究者通过醋氨酚（APAP）和过氧化氢（H2O2）体外诱导肝损伤[19]。APAP主要通过生成N-乙酰基-p-苯并喹非亚胺（NAPKI）并与肝蛋白的结合来介导肝损伤，而H2O2仅通过氧化应激途径诱发肝损伤。两者均可引起线粒体功能障碍，最终导致细胞凋亡。在两种损伤模型中，外泌体治疗组的细胞活力显著提高。结果表明，在肝再生过程中，启动期基因的上调可导致外泌体中增殖蛋白，如PCNA和cyclind1的高表达。此外，外泌体还可通过上调Bcl-xL蛋白抑制APAP-和H2O2诱导的肝细胞凋亡，但是外泌体不能通过调节氧化应激减轻肝细胞损伤。

二、间充质干细胞源性外泌体与自身免疫性肝炎

自身免疫性肝炎是由自身免疫反应介导的肝脏炎症性疾病，其确切病理生理机制尚不明确，相关研究表明，多种间充质干细胞源性外泌体含有TGF-β1、IL-6、IL-10和肝细胞生长因子（HGF）等细胞因子和生长因子，有助于免疫调节[20]。其中，IL-6可以促进幼稚T淋巴细胞分化为Th17细胞，分泌IL-17，促进AIH的发展。IL-1β可以将人Treg细胞转化为Th17细胞，Treg细胞可分泌IL-10，以维持肝脏免疫平衡和IL-10的耐受性[21]。miRNA-223-3p是PBMC和BMSC中高表达的miRNA，可调节炎症相关基因STAT3的表达，该基因是IL-1β和IL-6的重要上游激活因子，Treg和Th17细胞及其分泌的IL-10和IL17在AIH模型中增加。此外，STAT3还可激活RORT并促进Th17细胞中IL-17的分泌，在自身免疫性疾病中发挥重要作用。hUC MSC-Exos可作为载体将micro-RNA传递到细胞中，调节肝脏中IL-1β和IL-6的表达。Lu等[22]通过改变肝脏S100/CFA-小鼠脾脏中Treg和Th17细胞的比例，发现携带miRNA-223-3p的间充质干细胞源性外泌体显著提高了Treg/Th17的降低比率。其机制与miRNA-223-3p介导的对STAT3基因和炎性细胞因子（IL-1β和IL-6）表达的调节以及Treg/Th17比值的升高有关。其中，NLRP3属于炎性复合体的传感蛋白，异常NLRP3激活可能参与了自身免疫性疾病的进展。caspase-1可分泌促炎细胞因子，并诱导细胞焦亡，通过激活caspase-1，然后分泌IL-1β对内源性或外源性危险信号做出应答。Chen等[23]采用肝抗原S100建立小鼠自身免疫性肝炎模型，用LPS和ATP建立肝细胞细胞损伤模型，采用超速离心法分离骨髓间充质干细胞外泌体，通过血清ALT和AST的水平以及肝组织学来评估肝损伤，用炎症性细胞因子和乳酸酶脱氢酶分别检测炎症和细胞死亡。研究表明间，充质干细胞源性外泌体可通过miRNA-233途径来调控炎症小体NLRP3及caspase-1，通过与其3’-UTR结合抑制NLRP3的激活，导致NLRP3 mRNA降解，从而抑制肝脏炎症和细胞死亡。

三、间充质干细胞源性外泌体与肝纤维化/肝硬化

肝星状细胞（HSCs）通过细胞因子和生长因子的调节激活，导致肝纤维化发生。细胞外基质在增殖的HSCs协助下通过分泌胶原形成纤维瘢痕组织，但如果不适当地调节，则可导致肝硬化。损伤的上皮细胞释放的外泌体可促进a-SMA表达、F-actin表达、成纤维细胞增殖和Ⅰ型胶原的产生，成纤维细胞的活化依赖于外泌体中TGF-b1 mRNA的传递。TGF-β1在STAT3激活的HSCs中才具有促纤维化细胞因子和凋亡特性，此外，STAT3还可介导Bcl-2的转录。通过建立HST-T6或CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型，发现miR-181-5p可通过修饰STAT3和Bcl-2的3’UTR，减弱STAT3和Bcl-2基因的表达，同时通过下调STAT3通路介导TGF-β1信号传导，减轻肝组织纤维化程度[24][25]。Li[13]等研究者用四氯化碳诱导小鼠肝脏纤维化，通过肝脏内直接注射人脐带间充质干细胞外泌体，发现hucMSC-Ex移植到小鼠纤维化肝脏后血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性增加，而Ⅰ型和Ⅲ型胶原降低，并通过作用于TGF-β1和磷酸化Smad2在体内的表达，促进肝细胞损伤的恢复。另一项研究建立了CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型，注射hBM-MSCs-Ex治疗4周[26]。研究结果表明，体内注射hBM-MSCs-Ex可通过减少胶原蛋白沉积，增强肝功能，抑制炎症和促进肝细胞再生减轻肝纤维化。此外，该实验还发现，hBM-MSCs-Ex在体内和体外实验中均抑制Wnt/β-catenin通路，α-SMA和CollagenⅠ的表达。

四、间充质干细胞源性外泌体与肝癌

肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第四大常见原因，其发病机理及治疗的研究一直是肝癌研究的重点。相关研究发现，AMSC-Exo-199a具有典型的外泌体特性，可通过抑制其靶基因YAP1、CD151和mTOR的表达，导致细胞增殖、侵袭和迁移减少，从而增强阿霉素的敏感性。此外，静脉注射AMSC-Exo-199a可显著增强Dox在体内抗HCC的作用。除mTOR外，HK2、PKM2、PAK4等MiR-199a-3p介导的基因调控也被证明与肝癌有关[27]。另一项研究评估了来源于骨髓间充质干细胞和肝间充质干细胞的外泌体对二乙基亚硝胺（DEN）诱导的大鼠肝癌进展的潜在影响及其相关机制[28]。CSCs源性外泌体组小鼠的肝脏相对重量和血清肿瘤标志物和肝酶水平、HCC标志物、免疫染色强度、肿瘤的数量和面积均显著增加。表明CSCs源性外泌体具有显著的诱导肿瘤增殖、转移和血管生成的能力，可导致显著的肿瘤生长和进展。此外，CSCs外泌体增加了Bcl2、TGFβ1、NFκB、MMP9和VEGF基因的表达；增加了TGF-β1、P13K和ERK蛋白的表达；增加了PCNA的免疫染色；增加了血清TGF-β1的水平，但降低了Bax、p53和timp1 mRNA的水平。

五、间充质干细胞源性外泌体与其他肝脏疾病

大规模的流行病学调查和临床资料研究结果表明，酒精性肝病患者住院人数占同期全国肝病患者的比例逐年上升。研究显示，活性氧（ROS）在酒精性肝病的进展中发挥重要作用。ROS可激活NLRP3-caspase-1信号通路，介导相关促炎细胞因子（如IL-1β）释放[29]。此外，Treg/Th17比例的失衡也参与ALD的发生、发展。jin等[30]通过建立一个酒精性肝损害小鼠模型，分离提取间充质干细胞源性外泌体，在ald小鼠中进行MSCs-exo植入，最终发现MSCs-exo能够减轻由于乙醇引起的肝损害和脂质沉淀。具体的作用机制可能是通过调节Nrf-2/HO-1和NLRP3-caspase-1-IL-1β通路、恢复Treg和TH17细胞的比例平衡，最终降低肝内氧化应激和炎症水平。

六、总结与展望

本文通过分析间充质干细胞源性外泌体在自身免疫型肝炎、急性肝衰竭、肝硬化、肝癌等疾病中的功能与作用机制并做出简要的总结，为肝脏疾病的诊断和新药的研发工作提供了一种崭新的方法与思路。但目前的研究仅建立在小鼠模型的基础上，MSCs-exo用于治疗灵长类动物的效果仍然还有待考量，且关于MSCs-exo仍存在一些健康安全问题，但它在急慢性肝脏疾病的治疗上仍然具备很大的潜力，将MSCs-exo广泛地应用到肝脏疾病的临床诊断和治疗、改善疾病的预后等，都是我们目前研究工作中的重点，具有十分重要的意义。